馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)與應(yīng)用

邢錚，秦玉芝,2*，潘妃，曹可，王利群，賀熱情

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128；3.植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410082）

綜述

馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)與應(yīng)用

邢錚1，秦玉芝1,2*，潘妃1，曹可1，王利群3，賀熱情3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128；3.植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410082）

馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新、生理機(jī)制研究中占有重要地位。目前應(yīng)用于馬鈴薯的基因轉(zhuǎn)化方法主要有基因槍法、微束激光法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。隨著馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，相繼獲得了一批抗病毒、真菌、細(xì)菌性病害的種質(zhì)資源，并在基因功能研究材料創(chuàng)新上取得進(jìn)展，研究馬鈴薯的抗性機(jī)制，開展馬鈴薯基因的功能研究將會(huì)成為趨勢。

遺傳轉(zhuǎn)化；再生體系；種質(zhì)資源

馬鈴薯是世界上繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物。中國是世界上馬鈴薯生產(chǎn)第一大國[1,2]。由于遺傳背景狹窄，傳統(tǒng)的育種技術(shù)已難以承載馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新面臨的巨大挑戰(zhàn)[3]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過短短30年的發(fā)展,大大加速了農(nóng)作物更新?lián)Q代的速度及種植業(yè)結(jié)構(gòu)的變革[4]，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯病蟲害防治、改善品質(zhì)、創(chuàng)新種質(zhì)資源、生理機(jī)制研究等方面取得了很好的成果，陸續(xù)培育出了一些抗病抗蟲的轉(zhuǎn)基因新品種[1]，而且利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制造馬鈴薯基因突變體是進(jìn)行馬鈴薯生理機(jī)制和信號傳導(dǎo)研究的一條重要途徑[5]。

1 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是運(yùn)用重組DNA技術(shù)將外源目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞或組織，改變其遺傳組成后產(chǎn)生物質(zhì)及其后代的一整套技術(shù)。目前應(yīng)用于馬鈴薯的基因轉(zhuǎn)化方法主要有基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、微束激光穿刺轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。

1.1 基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是一種依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細(xì)胞，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑尦晒Φ貞?yīng)用于植物基因轉(zhuǎn)化，具有無宿主限制、可控度高、操作簡便迅速、受體類型廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但轉(zhuǎn)化成本高、嵌合體比率大、遺傳穩(wěn)定性差。

李昌等[6]在2002年應(yīng)用基因槍法成功轉(zhuǎn)化馬鈴薯‘費(fèi)烏瑞它’∶將攜帶有Fmdvp1全長基因的質(zhì)粒pBI131SP1用金粉作微彈轟擊莖段，獲得馬鈴薯再生植株。檢測分析證明已成功地將目的基因?qū)腭R鈴薯基因組中，且其PCR檢測得出的轉(zhuǎn)化率達(dá)7.6%。

1.2 微束激光穿刺轉(zhuǎn)化法

微束激光穿刺轉(zhuǎn)化法是利用微束激光照射受體材料，外源DNA便借助于細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓差經(jīng)穿刺小孔直接進(jìn)入組織細(xì)胞。這一設(shè)想首先在動(dòng)物和人的細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)并取得成功[7,8]。植物實(shí)驗(yàn)方面，王蘭嵐等[9]利用該技術(shù)首次獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。

隨后微束激光穿刺轉(zhuǎn)化法被應(yīng)用在馬鈴薯轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中。付道林等[10]利用微束激光穿刺技術(shù)，將菜豆Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因?qū)腭R鈴薯栽培品種，來提高馬鈴薯對真菌性病害的抗性。郭志宏等[11]用微束激光穿刺將RNA干擾載體導(dǎo)入馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’，其Southern-blot檢測結(jié)果顯示外源基因?qū)氲目截悢?shù)在2～4之間，這有別于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植株，農(nóng)桿菌導(dǎo)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株一般以單拷貝為主的特點(diǎn)，導(dǎo)入的外源基因是多拷貝的。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的Ti（誘瘤）質(zhì)?；騌i（誘根）質(zhì)粒T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯的外植體包括葉片、莖段和試管薯薄片。用葉片作外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的時(shí)間較早，周壯志等[12]用馬鈴薯葉片作外植體實(shí)現(xiàn)了Cry3A和Vhb基因向馬鈴薯的轉(zhuǎn)化。該試驗(yàn)中對轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行PCR和DNA印跡分析表明，外源基因已整合到馬鈴薯基因組中，且連續(xù)三代無性繁殖后轉(zhuǎn)基因仍存在。白云鳳等[13]建立了一種無標(biāo)記農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯葉盤的方法。在栽培品種‘紫花白’上的試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，遺傳轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5.1%。

薯片作外植體也應(yīng)用得較早，并且越來越多的實(shí)驗(yàn)室傾向于使用薯片作外植體。朱青等[14]所在的實(shí)驗(yàn)室在2004年用試管薯薄片作外植體將擬南芥低溫誘導(dǎo)Cor15a的啟動(dòng)子成功轉(zhuǎn)入馬鈴薯。再生植株的PCR檢測和PCR-Southern鑒定結(jié)果證明，Cor15a啟動(dòng)子已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)入到馬鈴薯植株基因組中。該實(shí)驗(yàn)室至今仍然使用薯片作為外植體，并有很好的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累。

隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，去除腋芽的馬鈴薯莖段被用作外植體，且實(shí)驗(yàn)證明比葉片更適合侵染轉(zhuǎn)化。辛翠花等[15]進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)基因植株獲得的實(shí)驗(yàn)，以‘Desiree’葉片和莖段為外植體，分別比較了不同轉(zhuǎn)化條件對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明∶以莖段為外植體，預(yù)培養(yǎng)2 d后以O(shè)D600=0.5的菌液侵染10 min，在加有1.0 mg∕L反式玉米素（ZT-t）的MS（加蔗糖20 g∕L）選擇培養(yǎng)基上的遺傳轉(zhuǎn)化率最高，其愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)80%，芽分化率可達(dá)70%。莖段材料的高分化率有助于提高轉(zhuǎn)化陽性率。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率相比基因槍法略低，但其對儀器設(shè)備要求較低，反而在實(shí)際操作中得到了更多的應(yīng)用。以上農(nóng)桿菌介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所用的外植體、誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成等總結(jié)于表1。

2 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)在種質(zhì)資源創(chuàng)新中的應(yīng)用

2.1 抗病毒性病害資源創(chuàng)新

馬鈴薯因病毒侵染使其種性退化和嚴(yán)重減產(chǎn)，而將病毒外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，合成的無毒病毒外殼可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，激發(fā)一系列防衛(wèi)反應(yīng)，產(chǎn)生組織或全株抗性。

自首次報(bào)道轉(zhuǎn)入煙草花葉病毒外殼蛋白基因的煙草和番茄具有抵抗病毒侵染的能力后[16]，相繼報(bào)道了轉(zhuǎn)入馬鈴薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白基因以及同時(shí)轉(zhuǎn)入PVX+PVY外殼蛋白基因的馬鈴薯株系[17-21]。宋艷茹等[22]將PVY外殼蛋白基因通過致瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種‘Favorita’、‘虎頭’和‘克新4號’。試驗(yàn)結(jié)果表明∶轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株染色體上整合有PVY-CP基因，并且轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中PLRV增殖情況較未轉(zhuǎn)入基因的對照有所降低，同時(shí)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯生長發(fā)育正常。南相日等[23]用PLO（Poly-L-Ornithine）將外源PLRV-CP基因?qū)氲健笪餮蟆|(zhì)體中，獲得了轉(zhuǎn)化后代。蚜蟲接種PLRV，結(jié)果比對照明顯抗PLRV，說明PLRV-CP基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。

表1 部分試驗(yàn)中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯所用外植體、培養(yǎng)基組成Table 1 Explants and medium composition in some Agrobacterium-mediated transform experiments

2.2 抗真菌性病害資源創(chuàng)新

轉(zhuǎn)基因技術(shù)使植物獲得抵抗真菌性病害能力的機(jī)理有∶降解真菌細(xì)胞壁；阻礙真菌蛋白質(zhì)合成；滲透蛋白殺菌；引起過敏反應(yīng)[24]。馬鈴薯真菌病以晚疫病為主。目前利用轉(zhuǎn)入降解細(xì)胞壁物質(zhì)基因來提高馬鈴薯抗晚疫病的能力。

李汝剛等[25]將缺失C端信號肽序列的Osmotin和在第96位氨基酸處發(fā)生琥珀突變的Osmotin置于CaMV雙35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)化馬鈴薯，獲得NPTⅡ抗性植株。且其研究表明∶Osmotin蛋白的胞外分泌賦予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片抗晚疫病的能力。李先平等[26]通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用Harpin轉(zhuǎn)化馬鈴薯四倍體品種‘大西洋’（Atlantic），獲得107個(gè)馬鈴薯轉(zhuǎn)化株系，其中7株的抗病性與對照相比差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果初步表明，Harpin已整合到馬鈴薯的基因組中并得到表達(dá)，提高了植株的晚疫病抗性。

2.3 抗細(xì)菌性病害資源創(chuàng)新

馬鈴薯細(xì)菌性病害主要有青枯病、黑脛病、軟腐病、環(huán)腐病、瘡痂病和紅芽病。其中青枯病的致病機(jī)理是致病菌通過傷口侵入，進(jìn)入木質(zhì)部并擴(kuò)散至植物上部，通過脂多糖識別寄主，產(chǎn)生大量胞外多糖造成維管束堵塞，分泌胞外蛋白酶降解細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致寄主植物快速萎蔫[27,28]。目前主要向馬鈴薯轉(zhuǎn)入抗菌肽基因來提高抗細(xì)菌性病害能力。

賈士榮等[29]將抗菌肽Cecropin B、Shiva A的單價(jià)基因Cecropin B、Shiva A及Cecropin B∕Shiva A雙價(jià)基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入中國7個(gè)馬鈴薯主栽品種（系）中,獲得了1050個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。抗病性鑒定從75個(gè)株系中篩選得到了3個(gè)比起始品種抗病性提高1～3級、達(dá)到中抗的株系。邢小萍[30]對馬鈴薯四倍體普通栽培種‘甘農(nóng)薯1號’通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化抗菌肽Shiva A基因進(jìn)行了初步研究，環(huán)腐病菌接種實(shí)驗(yàn)初步測定表明轉(zhuǎn)基因植株均具有一定的抗性。

2.4 基因功能研究材料創(chuàng)建

隨著馬鈴薯基因組測序工作取得的進(jìn)展，馬鈴薯基因功能的研究也進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。2013年沈云龍等[5]用pBI載體，以‘鄂馬鈴薯3號’為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，獲得一批T-DNA插入突變體，其中包含一個(gè)長薯形突變體株系。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新上的展望

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在的研究者在導(dǎo)入目的基因片段的同時(shí)，越來越多地傾向于避免和減少不必要核酸片段進(jìn)入受體植物，這樣不僅在一定程度上保證了生物安全性問題，也能減少非必要核酸片段對試驗(yàn)的影響，提高了研究成果的可靠性和真實(shí)度。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新上得到了很多的應(yīng)用，在獲得更多優(yōu)質(zhì)高效的品種的同時(shí)，研究馬鈴薯的抗性機(jī)制，以及開展馬鈴薯基因的功能研究將會(huì)成為未來的發(fā)展趨勢。

[1]王永鋒,欒雨時(shí).馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].中國馬鈴薯,2004, 18(4),227-231.

[2]王巖,吳禹,李兆波,等.種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用途徑分析[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2011,5:10-12.

[3]陳玨,秦玉芝,熊興耀.馬鈴薯種質(zhì)資源的研究與利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2010(8):70-73.

[4]儲(chǔ)成才.轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)育種:機(jī)遇還是挑戰(zhàn)？[J].植物學(xué)報(bào), 2013,48(1):10-22.

[5]沈云龍,謝婷婷,柳俊.馬鈴薯薯形突變體T-DNA插入側(cè)翼序列分析[J].中國馬鈴薯,2013,27(3):129-135.

[6]李昌,金寧一,王罡,等.基因槍法轉(zhuǎn)化馬鈴薯及轉(zhuǎn)基因植株的獲得[J].作物雜志,2003(1):12-14.

[7]Tsukakoshi M,Kurata S,Nomiya Y,et al.A novel method of DNA transfection by laser microbeam cell surgery[J].Appl Phys B, 1984,35:135-140.

[8]Tao W,Wiikinson J,Stanbridge E J,et al.Direct gene transfer into human cultured cells facilitated by laser micropuncture of the cell membrane[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:4180-4184.

[9]王蘭嵐,傅榮昭,宋桂英,等.利用激光微束穿刺法將外源基因?qū)胄←湹难芯縖J].遺傳學(xué)報(bào),1995,22(5):394-399.

[10]付道林,王蘭嵐,藍(lán)海燕,等.將抗真菌病基因?qū)腭R鈴薯的研究[J].激光生物學(xué)報(bào),2000,9(3):189-193.

[11]郭志宏,張金文,陳正華,等.利用RNA干涉技術(shù)及微束激光轉(zhuǎn)化法培育抗病毒馬鈴薯[J].激光生物學(xué)報(bào),2006,15(5): 525-531.

[12]周壯志,周永剛,何朝族,等.cry3A和vhb基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2004,31(8):741-745.

[13]白云鳳,張維鋒,白冬梅,等.一種馬鈴薯高效無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立[J].西北植物學(xué)報(bào),2007,27(12):2361-2365.

[14]朱青,宋波濤,柳俊,等.擬南芥低溫誘導(dǎo)cor15a基因的啟動(dòng)子克隆及在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2004,12(5):500-504.

[15]辛翠花,郭江波,黃三文,等.馬鈴薯Desiree遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得[J].中國蔬菜,2011(6):15-21.

[16]Powell A P,Nelson R S,De B,et al.Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene[J].Science,1986,232:738-743.

[17]Homenway C,Fang R X,Kaniewski W K,et al.Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisepses RNA[J].EMBO J,1988,7: 1273-1280.

[18]Hoekema A,Huisman M J,Molendijk L,et al.The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X[J].Bio∕Technology,1989,7:273-278.

[19]Farinelli L,Malno P,Collet G F.Heterogonous encamps ideation of potato virus Y strain O(PVYO)with the transgenic coat protein of PVY rain N(PVYN)in Solanum tuberosum cv.Bintje[J].Bio∕Technology,1992,10:1020-1025.

[20]Kawchuk L M,Martin R R,McPherson J.Resistance in transgenic potato expressing the potato leaf roll virus coat protein gene[J]. Mol Plant-Microbe Interact,1990,3:301-307.

[21]Lawson C,Kaniewski W,Haley L,et al.Engineering resistance to mixed virus infection in a commercial potato cultivar:resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic Russet Burbank [J].Bio∕Technology,1990,8:127-134.

[22]宋艷茹,馬慶虎,侯林林,等.轉(zhuǎn)PVY外殼蛋白基因馬鈴薯及其田間試驗(yàn)[J].植物學(xué)報(bào),1996,38(9):711-718.

[23]南相日,劉文萍,韓玉琴,等.PLO介導(dǎo)PLRV-CP基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯獲轉(zhuǎn)基因抗性植株[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(3):1-3.

[24]舒群芳,孫勇如.抗真菌植物基因工程的策略和進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào),1997,39(1):91-96.

[25]李汝剛,伍寧豐,范云六,等.表達(dá)Osmotin蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對晚疫病的抗性分析[J].生物工程學(xué)報(bào),1999,15(2):135-140.

[26]李先平,何云昆,陳善娜,等.表達(dá)HarpinEa基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的晚疫病抗性分析[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1994,15(2):135-140.

[27]Etchebar C,Trigalet-Demery D,van Gijsegem F,et al.Xylem colonization by an HrcV-mutant of Ralstonia solanacearum is a key factor for the efficient biological control of tomato bacterial wilt[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1998,11,869-877.

[28]Vasse J,Frey P,Trigalet A.Microscopic studies of intercellular infection and protoxylem invasion of tomato roots by Pseudomonas solanacearum[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1995,8, 241-251.

[29]賈士榮,屈賢銘,馮蘭香,等.轉(zhuǎn)抗菌肽基因提高馬鈴薯對青枯病的抗性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1998,31(3):5-12.

[30]邢小萍.抗菌肽基因?qū)腭R鈴薯“甘農(nóng)薯1號”的初步研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2004(11):12-15.

Application and Technology of Potato Transformation

XING Zheng1，QIN Yuzhi1,2＊，PAN Fei1，CAO Ke1，WANG Liqun3，HE Reqing3
(1.College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China；2.Hunan Provincial Engineering Research Center for Potatoes,Changsha,Hunan 410128,China；3.Hunan Province Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation,Changsha,Hunan 410082,China)

ract:Potato transgenic technology plays an important role in germplasm enhancement and physiological mechanism research.Currently used potato genetic transformation methods include particle bombardment,micro-beam laser method and Agrobacterium-mediated transformation.With the development of potato transgenic technology,a number of anti-viral,fungal,bacterial diseases germplasm and some gene function study materials have been accessed,which will become a trend to research potato resistance mechanisms and gene function studies.

rds:genetic transformation；regeneration system；germplasm

S532

A

1672－3635（2013）06-0370-04

2013-10-25

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題“馬鈴薯綜合育種技術(shù)研究與新品種選育”(2012BAD02B05-8)；農(nóng)業(yè)部馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“南方冬作區(qū)稻田栽培”(CARS-10-P19)；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)“南方丘陵旱地帶狀復(fù)合種植系統(tǒng)高產(chǎn)高效關(guān)鍵技術(shù)研究”(201203096)；2012年湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2012B299)。

邢錚（1987-），男，碩士研究生，主要從事馬鈴薯逆境生理方面的研究。

秦玉芝，副教授，主要從事逆境生理與蔬菜遺傳育種方面的研究，E-mail∶qyuz@163.com。