內(nèi)皮祖細胞對心血管疾病的作用

張玉靜(綜述)，芶大明(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州遵義 563099)

內(nèi)皮祖細胞是一群具有游走及增殖分化功能的幼稚細胞，主要來源于骨髓，對其定義主要為表達或共表達CD34/CD133/CD309表面抗原的一類干細胞，這類細胞在體外能增殖形成細胞集落，并逐漸分化為成熟內(nèi)皮細胞。在心血管疾病病人體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量減少，同時伴隨其功能的降低。在臨床應(yīng)用他汀類藥、ACEI、胰島素等治療能誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞的動員和釋放，并通過VEGF/Akt/eNOS等通路參與病變血管的修復(fù)及改善病人的預(yù)后。

1 EPC的來源、鑒定及計數(shù)

1997年Asahara等首次從循環(huán)外周血中提取單個核細胞，用內(nèi)皮專用的培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了能增殖分化形成內(nèi)皮細胞集落的一種干細胞，考慮到其作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，命名為內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)［1］。隨后 Murohara等在臍帶血中發(fā)現(xiàn)了能在體外誘導(dǎo)下分化為成熟內(nèi)皮細胞的一種干細胞，認為臍血中也存在EPCs［2］。EPCs主要來源于骨髓，此外亦有可能來源于脂肪組織/血管壁(尤其是外膜)/脾臟/肝臟及腸道［3］。

EPCs是一群具有游走及增殖分化功能的幼稚細胞，在分化過程中會表達某些表面分子，利用流式細胞技術(shù)對特定的標記物分析能從外周血/臍血以及骨髓中檢測到并計數(shù)EPCs。EPCs最基本的特點是具有增殖能力，在體外用特定的培養(yǎng)基(EGM－2/M199)，一周左右能增殖分化形成細胞集落，形態(tài)多呈鋪路石樣，中間細胞較密集，周圍細胞呈放射狀分布，此類細胞能攝取DiL(1，1＇－dioctadecyl－ 3，3，3＇，3＇－ tetramethylindocarbocyanine perchlorate)標記的乙?；兔芏戎鞍?acLDL)，并且其細胞膜表達的某些分子能和荊豆凝集素1(Ulex europaeus agglutinin－1 lectin，UEA －1)結(jié)合［4］。對EPCs的鑒定，常用的表面分子抗原的組合是CD34+、血管內(nèi)皮生長因子受體－2(CD309+)和CD133+分子，任何一種單獨的表面分子對EPCs來說都沒有特異性，并且EPCs在分化的過程中，逐漸弱表達或不表達CD133+這個表面分子，丟失CD133這個表面分子意味著向更成熟的內(nèi)皮樣細胞分化，此過程可能主要發(fā)生在EPCs從骨髓遷移到外周血的早期，成熟的內(nèi)皮細胞不表達CD133分子［5］。因此，同時表達 CD133/CD34/CD309的細胞稱為早期EPCs，晚期的EPCs弱表達或不表達CD133且逐漸表達內(nèi)皮細胞的標記如:CD31和von Willebrand factor等。

對EPCs的計數(shù)缺乏標準的方法，流式細胞技術(shù)能同時對多種表面標記進行分析，但通過流式細胞技術(shù)定義EPCs比較抽象，只是某一種或多種抗原組合陽性的細胞類型［4］。EPCs主要存在于骨髓，外周血的含量極少，利用EPCs的增殖能力這一特性，通過體外培養(yǎng)擴增的方法，對其有增殖能力的細胞進行內(nèi)皮系方面的相關(guān)檢測，染DiL－ac－LDL(帶DiL熒光的acLDL)和FITC－UEA1(帶FITC熒光的 UEA1，F(xiàn)ITC－ fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)，計數(shù)其集落數(shù)［4－5］，此方法缺點亦較明顯，體外條件與體內(nèi)的不一致將導(dǎo)致一定程度的失真，且計數(shù)亦有較大的不準確性［4］。兩種方法各有優(yōu)缺點，多結(jié)合兩種方法，用流式細胞技術(shù)計數(shù)體內(nèi)EPCs含量，而體外擴增則有鑒定的作用，能驗證EPCs的增殖、分化及遷移能力［6］。

2 EPC的動員及血管內(nèi)皮修復(fù)作用

骨髓有“干細胞庫”之稱，EPCs的動員主要依賴局部的微環(huán)境改變。各種動員因子抑制干細胞和間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，最后干細胞通過跨內(nèi)皮遷移離開骨髓到外周血中，間質(zhì)細胞上有能與造血干細胞結(jié)合素類結(jié)合的位點，許多蛋白酶類的激活能裂解此類結(jié)合位點，從而抑制這種轉(zhuǎn)化，如彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、基質(zhì)金屬蛋白酶。缺血被看作是引起EPCs由骨髓向外周血動員的主要信號，缺血通過上調(diào)VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、SDF－1(基質(zhì)細胞衍生因子1)等因子水平，通過依賴基質(zhì)金屬蛋白酶－9的機制而動員 EPCs［6］。影響 EPCs數(shù)量和功能的因素有很多，VEGF、SDF－1、集落刺激因子(GM －CSF、G －CSF、EPO)、他汀類藥、PPARγ激動劑(羅格列酮)、雌激素和體育訓(xùn)練等均能一定程度誘導(dǎo)和加強EPCs的動員［6－7］。神經(jīng)生長因子(NGF)能促進CD34陽性細胞增殖，能增加CXCR－4(一種EPCs遷移和歸巢的重要細胞因子受體)在CD34+陽性細胞的表達，且導(dǎo)致其向SDF－1遷移能力增強，還能增加其血管樣結(jié)構(gòu)形成的能力［8］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)巨噬細胞遷移抑制因子在EPCs動員中起重要作用，且能在體外促進 EPCs趨化［9］。

過去，對受損的血管內(nèi)皮的修復(fù)及再生，總認為其機制是通過鄰近的血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移來完成。隨著研究的深入，此修復(fù)過程有其他機制參與。其一，循環(huán)EPCs能歸巢于球囊造成的動脈內(nèi)皮剝脫的部位，促進動脈內(nèi)皮的再內(nèi)皮化，這可能與內(nèi)皮抗增殖介質(zhì)如NO的合成有關(guān);其二，在狗身上可以看到，移植到其體內(nèi)的滌淪移植片表面迅速被表達CD34標記的造血干細胞覆蓋，同時在人的很多血管輔助裝置表面，都能被共表達CD133和VEGFR－2的干細胞覆蓋;其三，利用骨髓移植試驗也發(fā)現(xiàn)骨髓來源的細胞對移植物和裸露的血管的再內(nèi)皮化有作用［6］。這些研究表明，血管內(nèi)皮損傷后的再內(nèi)皮化與內(nèi)皮祖細胞有很大的關(guān)系。

體外實驗表明:EPCs能在體外擴增并分化為內(nèi)皮細胞［1，5］，并能形成血管樣結(jié)構(gòu)［1，10－11］。將外周血單個核細胞來源的體外擴增的EPCs注入后肢缺血動物，能明顯改善缺血狀況及增加新生血管的形成［12－14］。以上研究表明，EPCs能分化為內(nèi)皮細胞參與內(nèi)皮的修復(fù)，并能參與出生后的新生血管形成，與血管病變?nèi)缧难芗膊?、風(fēng)濕血管改變、糖尿病血管并發(fā)癥等有密切聯(lián)系。

3 EPC與心血管疾病

心血管疾病多表現(xiàn)為血管功能的失衡，主要以血管內(nèi)皮的損傷及修復(fù)失衡作為其發(fā)病的病理生理機制，而EPCs作為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，使得大量的學(xué)者想到其可能參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)。

心血管危險因素能預(yù)測心血管事件發(fā)生的可能性大小。Hill的研究表明，心血管危險因素和EPCs的數(shù)量和功能之間有密切的聯(lián)系。心血管危險因素越高，則病人外周血 EPCs含量就越少。Mariuca通過對冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)和正常人研究發(fā)現(xiàn):有CAD的病人組EPCs數(shù)量較正常人組明顯減少，其遷移能力降低［15］，且心血管危險因素和 EPCs水平成負相關(guān)［16］。Caroline等對伴有CAD的病人進行分析，發(fā)生心血管事件(心血管死亡、不穩(wěn)定心絞痛、心梗、經(jīng)皮冠狀動脈血管腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動脈搭橋或缺血性中風(fēng))的病人有著較低水平的EPCs，即EPCs數(shù)量的減少預(yù)示著將會導(dǎo)致較高的心血管事件的發(fā)生率［17］。EPCs在維持血管內(nèi)皮完整性和穩(wěn)態(tài)方面有重要作用，在心血管功能失衡的病人體內(nèi)，機體從骨髓里動員EPCs釋放到外周血后，起到修復(fù)失衡血管內(nèi)皮及減緩心血管病變發(fā)展進程的作用，因此EPCs水平能獨立預(yù)測心血事件的發(fā)生及發(fā)展［17－18］。

在退行性變主動脈瓣狹窄病人中，EPCs的數(shù)量和功能相比正常人都不同程度受損，提示了EPCs數(shù)量和功能的改變可能參與瓣膜退行性變的進程［19］。先天性主動脈瓣二葉式畸形(BAV)病人中，EPCs亦可能參與主動脈瓣膜的修復(fù)，延緩主動脈瓣變性的進程，于是在BAV病人中，發(fā)現(xiàn)有中度瓣膜狹窄/返流者比無狹窄/返流者外周血EPCs水平低，且遷移能力下降［20］。

急性心梗病人早期亦有EPCs的動員以參與阻塞血管的修復(fù)和再通［21］，心梗后7d左右，EPCs的動員達高峰。Thomas等利用鼠急性心梗模型，發(fā)現(xiàn)心梗后早期(7d前)可能由于骨髓內(nèi)活性氧簇的增加以及金屬蛋白酶9受損，減少了EPCs的動員［22］。利用心梗動物模型，與對照組相比，注射體外擴增的EPCs后，能增高心肌梗塞區(qū)血管密度及梗死心肌瘢痕邊緣毛細血管密度，縮小梗塞心肌面積，能提高左室射血分數(shù)明顯改善心臟血供和心功能，并且降低左室疤痕形成［22－23］。有學(xué)者嘗試將體外擴增的EPCs用于心梗病人，能明顯改善冠狀動脈血流儲備和左室功能［25］。趙子粼等對38例心梗后心衰的患者，利用皮下注射G－CSF(粒細胞集落刺激因子)600 ug/d連續(xù)7d來動員內(nèi)皮祖細胞，發(fā)現(xiàn)可有效改善心功能，減輕心室重構(gòu)，降低心肌能量消耗［26］。

合并微量白蛋白尿的高血壓病人有內(nèi)皮細胞凋亡的增加和循環(huán)EPCs水平的降低［27］，高血壓引起EPCs損傷的機制可能與腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)活性增高有關(guān)，可能因為血管緊張素2降低EPCs端粒酶活性，并通過增加氧化應(yīng)激加速EPCs衰老，同時醛固酮可以減少血管內(nèi)皮生長因子受體2的表達以及抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，從而抑制骨髓EPCs的分化。

此外，Gerhard－paul等報道在特發(fā)性肺動脈高壓病人外周血內(nèi)循環(huán)EPCs數(shù)目明顯較正常人減少［28］。內(nèi)皮功能障礙在肺動脈高壓(PAH)的發(fā)病機制中起重要作用，在伴有PAH的鐮刀型紅細胞貧血病人中EPCs及其亞型明顯較不伴PAH的病人低，較低的EPCs可能與肺血管的病理改變有關(guān)［29］。

4 EPC與臨床應(yīng)用

想成功利用EPCs為臨床服務(wù)是一個復(fù)雜的多步驟的過程，其包括EPCs的動員、歸巢到特定的部位、粘附、進一步的分化以及功能的整合［30］。同時EPCs具體修復(fù)血管的具體機制仍未完全被了解，沒有一個統(tǒng)一的可以令大家都信服的機制。且在某些因素影響下，EPCs可能對疾病沒有治療作用，反而起到消極作用。

他汀類藥和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是臨床心血管病人常用的藥物，研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥能通過增強內(nèi)皮型一氧化氮的生物利用率而增加了EPCs的動員，從而增加心肌新生血管形成、改善了左室收縮功能、抑制了心肌纖維化以及提高了心梗后的存活率［31］。他汀類還可以通過 PI3K/Akt通路而增強EPCs增殖及分化［32］。ACEI(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)類藥(雷米普利)治療能增加CAD病人的外周血EPCs數(shù)量以及增強EPCs修復(fù)缺血損傷的功能［14］。他汀類藥和ACEI可能通過不同的藥物作用機制影響骨髓內(nèi)的某些分子表達水平而增加了EPCs的動員［22］。

心血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，有研究發(fā)現(xiàn)胰島素具有重要的心血管保護作用，能促進EPCs從骨髓動員到外周血，增加了后肢缺血鼠模型的毛細血管密度;胰島素治療也恢復(fù)了缺血誘導(dǎo)SDF－1α 和VEGF的釋放，加強Akt、eNOS(內(nèi)皮型NO合酶)和骨髓內(nèi)MMPE－9的活性;表明胰島素治療能通過VEGF/Akt/eNOS相關(guān)通路引起的EPCs的動員從而增加糖尿病鼠新生血管的形成改善缺血［33］。

任何事物都有兩面性，EPCs在產(chǎn)生有利作用的同時在某些方面仍會起到消極的作用，Pelliccia等對155例連續(xù)被診斷為心絞痛的患者，在行選擇性經(jīng)皮冠狀動脈支架置入前取外周血行流式細胞儀測定EPCs含量，8個月后行血管造影發(fā)現(xiàn)再狹窄的患者比健康對照組及其它沒有狹窄的患者組都具有更多的內(nèi)皮祖細胞及其亞群［34］。EPCs可能參與血管內(nèi)膜的增生，引起再狹窄。

5 展望

EPCs在血管疾病變方面有較大的治療前景，對心血管疾病、糖尿病以及其它以血管病變?yōu)榛A(chǔ)的疾病均有一定的預(yù)測和治療作用。心血管疾病目前治療手段費用昂貴以及效果并不十分完美，所以EPCs的發(fā)現(xiàn)可能會為未來預(yù)防和治療此類疾病產(chǎn)生深遠影響。想要成功利用EPCs為臨床服務(wù)，還需解決多種問題:①加強對EPCs的基礎(chǔ)理論知識方面的研究，目前對EPCs并未發(fā)現(xiàn)其唯一的表面分子，各學(xué)者所用的表面抗原組合各有不同，且各表面分子缺乏一定的特異性，另外對其動員、釋放、歸巢、血管形成的確切機制并不十分清楚;②加大動物實驗的研究，以期解決好體外擴增EPCs回輸體內(nèi)后的安全性及EPCs體外培養(yǎng)的純度等問題;③增加大樣本的臨床病例研究，目前臨床應(yīng)用方面多只是觀察到EPCs數(shù)量和功能的改變與CAD有關(guān)系，用體外擴增EPCs再回輸體內(nèi)的方法仍有一定的技術(shù)問題需要解決，用某些誘導(dǎo)劑刺激EPCs動員也其動員效果比較有限且有一定的其它方面的影響。隨著研究的深入，以期將來能準確掌握EPC的作用機制，更好更安全的為臨床服務(wù)。

［1］Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］.Science，1997，275(5302):964－967.

［2］Murohara T，Ikeda H，Duan J.Transplanted cord bloodderived endothelial progenitor cells augment postnatal neovascularization［J］.J Clin Invest，2000，105(11):1527－1536.

［3］Xu Q.Progenitor cells in vascular repair［J］.Curr Opin Lipidol，2007，18:534 －539.

［4］Fadini G P，Baesso I，Zeiher A M，et al.Technical notes on endothelial progenitor cells:ways to escape from the knowledge plateau［J］.Atherosclerosis，2008，197:496－503.

［5］Carmen Urbich，Stefanie Dimmeler.Endothelial progenitor cells characterization and role in vascular biology［J］.Circulation Research，2004，95:343 －353.

［6］Hill J M，Zalos G，Halcox J P，et al.Circulating endothelial progenitor cells，Vascular function and Cardiovascular risk［J］.NEGM，2003，348:593－600.

［7］余華，張懷勤.內(nèi)皮祖細胞的動員及影響因素［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2005，12(6):809 －812.

［8］Jadhao C S，Bhatwadekar A D，Jiang Y，et al.Nerve growth factor promotes epc－mediated angiogenic responses［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(4):2030－2037.

［9］Grieb G，Piatkowski A，Simons D，et al.Macrophage migration inhibitory factor is a potential inducer of endothelial progenitor cell mobilization after flap operation［J］.Surgery，2012，151(2):268 －277.

［10］Kimiko Yamamoto，Tomono Takahashi，Takayuki Asahara，et al.Proliferation，differentiation，and tube formation by endothelial progenitor cells in response to shear stress［J］.Journal of Applied Physiology，2003，95:2081－2088.

［11］Aihua Li，Xiao J Cheng，Aune Moro，et al.CXCR2 －dependent endothelial progenitor cell mobilization in pancreatic cancer growth［J］.Translational Oncology，2011，4(1):20－28.

［12］Urbich C，Heeschen C，Aicher A，et al.Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor cells［J］.Circulation，2003，108:2511－2516.

［13］Christoph Kalka，Haruchika Masuda，Tomono Takahashi，et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.PNAS，2000，(7):3422 －3427.

［14］Tao Qian Min，Chen Jun Zhu，Wang Xing Xiang，et al.Improvement in endothelial progenitor cells from peripheral blood by ramipril therapy in patients with stable coronary artery disease［J］.Cardiovascular Drugs and Therapy，2004，18(3):203－209.

［15］Tiffany M P，Jonathan D.P，Jonathan M H，et al.Granulocyte colony－stimulating factor mobilizes functional endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease［J］.Thrombosis And Vascular Biology，2005，25:296－301.

［16］Mariuca Vasa，Stephan Fichtlscherer，Alexandra Aicher，et al.Number and Migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease［J］.Circulation Research，2001，89:1－7.

［17］Caroline Schmidt－ Lucke，Lothar Rossig，Stephan Fichtlscherer，et al.Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events［J］.Circulation，2005，111:2981 －2987.

［18］Bakogiannis C，Tousoulis D，Briasoulis A，et al.Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes［J］.Curr Med Chem，2012，19(16):2597－2604.

［19］Yasuharu Matsumoto，Volker Adams，Claudia Walther，et al.Reduced number and function of endothelia progenitor cells in patients with aortic valve stenosis:a novel concept for valvular endothelial cell repair［J］.European Heart Journal，2009，30(3):346 －355.

［20］Vaturi M，Perl L，Leshem － Lev D，et al.Circulating endothelial progenitor cells in patients with dysfunctional versus normally functioning congenitally bicuspid aortic valves［J］.Am J Cardiol，2011，108(2):272 －276.

［21］Margherita Massa，Vittorio Rosti，Maurizio Ferrario，et al.Increased circulating hematopoietic and endothelial progenitor cells in the early phase of acute myocardial infarction［J］.Blood，2005，105(1):199 －206.

［22］Thomas T，Daniela F，Paolo G，et al.Bone marrow molecular alterations after myocardial infarction:Impact on endothelial progenitor cells［J］.Cardiovascular Research，2006，70(1):50－60.

［23］Kawamoto A，Gwon H C，Iwaguro H，et al.Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia［J］.Circulation，2001，103:634 －637.

［24］陳圖剛，譚維羚，馬戰(zhàn)清，等.內(nèi)皮祖細胞移植對犬心肌梗死后血管新生、心肌修復(fù)及心功能的影響［J］.實用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11(3):12 －15.

［25］Assmus B，Schachinger V，Teupe C，et al.Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction(TOPCARE －AMI)［J］.Circulation，2002，106:3009 －3017.

［26］趙子粼，許頂立，郭志剛，等.內(nèi)皮祖細胞對心肌梗死后心力衰竭患者心功能及心肌能量消耗的影響［J］.臨床心血管雜志，2011，27(7):526 －530.

［27］Huang P H，Huang S S，Chen Y H，et al.Increased circulating CD31+/annexin V+apoptotic microparticles and decreased circulating endothelial progenitor cell levels in hypertensive patients with microalbuminuria［J］.Hypertens，2010，28(8):1655 －1665.

［28］Gerhard － Paul Diller，Sven van Eijl，Darlington O，et al.Circulating endothelial progenitor cells in patients with eisenmenger syndrome and idiopathic pulmonary arterial hypertension［J］.Circulation，2008，117:3020 －3030.

［29］Anjum F，Lazar J，Jamaleddine G，et al.Characterization of altered patterns of endothelial progenitor cells in sickle cell disease related pulmonary arterial hypertension［J］.Pulm Circ，2012，2(1):54－60.

［30］Urbich C，Dimmeler S.Endothelial progenitor cells:characterization and role in vascular biology［J］.Circ Res，2004，95:343－353.

［31］Ulf Landmesser，Niels Engberding，F(xiàn)erdinand H，et al.Statin－induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization，myocardial neovascularization，left ventricular function，and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase［J］.Circulation，2004，110:1933 －1939.

［32］Stefanie Dimmeler，Alexandra Aicher，Mariuca Vasa，et al.HMG －CoA reductase inhibitors(statins)increase endothelial progenitor cells via the PI3－kinase/Akt pathway［J］.J Clin Invest，2001，108(3):391 －397.

［33］Dong L，Kang L，Ding L，et al.Insulin modulates ischemia－induced endothelial progenitor cell mobilization and neovascularization in diabetic mice［J］.Microvasc Res，2011，82(3):227 －236.

［34］Pelliccia F，Cianfrocca C，Rosano G，et al.Role of endothelial progenitor cells in restenosis and progression of coronary atherosclerosis after percutaneous coronary intervention:a prospective study［J］.JACC Cardiovasc Interv，2010，3(1):78－86.