銜接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9與抗結(jié)核免疫的相關(guān)性

孫蕾 鄭錦輝 王毳 費(fèi)思平 趙卓

結(jié)核病是一種慢性傳染病，全球每年約有170萬(wàn)例患者死于結(jié)核感染［1］。我國(guó)結(jié)核病患者例數(shù)居世界第二位，也是耐藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一，因結(jié)核病死亡的人數(shù)超過(guò)其他傳染病死亡人數(shù)的總和。因此，研制有效的抗結(jié)核藥物和新型疫苗迫在眉睫。這需要對(duì)宿主與Mtb相互作用機(jī)制、抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其關(guān)鍵分子進(jìn)行深入理解。

Mtb進(jìn)入人體后，Mtb表面病原體相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）被模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別［2］，巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞均表達(dá)PRRs［3］。PRRs與PAMPs結(jié)合后，PRRs將信號(hào)傳遞給銜接分子，后者啟動(dòng)下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)固有免疫細(xì)胞合成細(xì)胞因子，活化宿主免疫。一個(gè)銜接蛋白可接受多種受體的信號(hào)，因此，銜接蛋白在宿主免疫中起著關(guān)鍵作用。胱天蛋白酶募集域蛋白 9（caspase recruitment domain－containing protein 9，CARD9）能識(shí)別多種Mtb受體［4］，在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮著重要作用。以下僅對(duì)CARD9及其在抗結(jié)核免疫中的作用機(jī)制進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

CARD9的結(jié)構(gòu)與分布

CARD9屬于CARD蛋白家族，位于染色體9q34．3，cDNA全長(zhǎng)2108bp，編碼536個(gè)氨基酸殘基，合成相對(duì)分子質(zhì)量為62 300的蛋白質(zhì)。CARD9有2個(gè)功能區(qū)，一個(gè)位于CARD9的N末端，為胱天蛋白酶募集域，有7～98個(gè)氨基酸殘基。另一個(gè)位于C末端，由7肽重要特征的卷曲螺旋域組成，至少有3個(gè)氨基酸殘基段，分別為140～230、243～277、332～419的卷曲螺旋域，這個(gè)區(qū)域?qū)τ诘鞍椎墓丫刍δ芫哂兄匾饔茫?］。CARD9在多種組織中表達(dá)，包括肺、肝、脾、子宮、外周血和骨髓。CARD9在骨髓源細(xì)胞中表達(dá)，如樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和骨髓源巨噬細(xì)胞（bone marrow－derived macrophages，BMDMs）等，而在淋巴結(jié)和T、B細(xì)胞中不表達(dá)［3］。

CARD9在抗結(jié)核免疫中的作用

一、CARD9是傳遞多種識(shí)別Mtb相關(guān)受體信號(hào)的中心分子

Mtb細(xì)胞壁表面包含大量結(jié)構(gòu)不同的分子，分別由不同的PRRs識(shí)別。含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine－based activation motif，ITAM）的受體與相應(yīng)配體作用后，活化銜接分子CARD9，CARD9與Bcl10／Malt1信號(hào)作用模塊結(jié)合，形成三分子復(fù)合體，將信號(hào)傳導(dǎo)給轉(zhuǎn)錄因子NF－κB途徑［6］。銜接分子CARD9與多個(gè)信號(hào)途徑有關(guān)，是多種識(shí)別Mtb受體下游的中心銜接分子。CARD9選擇性接受來(lái)自BMDMs的dectin－1受體、NOD2（nucleotidebinding oligomerization domain－containing protein 2）類(lèi)受體和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)性C型凝集素樣受體（MINCLE）的信號(hào)，與脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）和（或）CARD9相關(guān)的受體對(duì)控制Mtb的固有免疫至關(guān)重要［7］。上述受體分別與抗結(jié)核的前炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)少量腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）釋放和誘導(dǎo)少量細(xì)胞活化有關(guān)。

二、CARD9是控制結(jié)核固有免疫的重要分子

作為傳遞多種識(shí)別 Mtb受體信號(hào)的中心分子［8］，CARD9是控制結(jié)核病必不可少的。Mtb的大量繁殖和過(guò)度的炎癥導(dǎo)致感染結(jié)核CARD9敲除（CARD9－／－）鼠的死亡，同時(shí)，依賴(lài)CARD9的中性粒細(xì)胞又是控制結(jié)核固有免疫所必須。強(qiáng)調(diào)了固有免疫在結(jié)核保護(hù)和病理中的雙重作用。細(xì)菌繁殖和炎癥控制對(duì)疾病的預(yù)后有決定性作用［4］。

（一）CARD9缺陷導(dǎo)致Mtb感染鼠嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)

在感染Mtb前3周，CARD9－／－鼠體內(nèi)出現(xiàn)更高的菌濃度，肺部浸潤(rùn)大量中性粒細(xì)胞，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡率增加，肺實(shí)質(zhì)死亡細(xì)胞清除減弱，肉芽腫形成減少，致死性病理過(guò)程伴隨以加速的炎細(xì)胞積累為特征的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)［4］。

1．Mtb感染CARD9－／－鼠肺部大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制：Mtb感染CARD9－／－鼠的肺部損傷以中性粒細(xì)胞炎癥和繼發(fā)性壞死的細(xì)胞凋亡為特征，這些病理特征與局部合成粒細(xì)胞集落刺激因子（G－CSF）、角化上皮來(lái)源的化學(xué)因子（keratinocyte－derived chemokine，KC）、單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1）和系統(tǒng)釋放G－CSF有關(guān)。這些細(xì)胞因子由BMDMs、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成，進(jìn)而刺激粒細(xì)胞合成，并招募粒細(xì)胞到感染組織部位。

在感染期間，KC的合成增強(qiáng)，不成熟粒細(xì)胞被釋放到外周。G－CSF刺激中性粒細(xì)胞分化成熟和功能活化。G－CSF和KC刺激、趨化骨髓來(lái)源的粒細(xì)胞移動(dòng)到感染部位。CARD9－／－鼠體內(nèi)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞分化和招募的MCP－1和細(xì)胞因子升高，誘導(dǎo)粒細(xì)胞到達(dá)外周，KC加速招募粒細(xì)胞到肺部。因此，在感染組織部位能檢測(cè)到多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）轉(zhuǎn)錄，CARD9－／－鼠血清中粒細(xì)胞來(lái)源的髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）濃度增加。

CARD9是Mtb感染的PMN合成白細(xì)胞介素－10（interleukin－10，IL－10）必不可少的［4］。CARD9－／－鼠IL－10缺 失使其對(duì)各種細(xì)胞因子和化學(xué)因子的負(fù)反饋喪失，IL－10負(fù)反饋調(diào)節(jié)的缺乏導(dǎo)致粒細(xì)胞炎癥的惡性循環(huán)和無(wú)效的凋亡細(xì)胞清除，增加了炎癥反應(yīng)。

2．大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是導(dǎo)致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的關(guān)鍵因素：為了解中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)CARD9－／－鼠生存的影響，采用兩種治療方法并進(jìn)行評(píng)估。第一種治療方法用洛伐他汀治療 Mtb感染CARD9－／－鼠，加速除去肺部的凋亡細(xì)胞，緩解凋亡細(xì)胞引起的繼發(fā)壞死，減輕組織損傷。第二種治療方法用抗體中和G－CSF，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。對(duì)兩種治療方法進(jìn)行評(píng)估，前者不能改善CARD9－／－鼠生存，而后者能有效延長(zhǎng)Mtb感染CARD9－／－鼠的生存時(shí)間，改善肺部炎癥，減少肺部炎細(xì)胞，降低血液中粒細(xì)胞水平和MPO濃度。因此，限制炎癥和肺部粒細(xì)胞浸潤(rùn)是延長(zhǎng)Mtb感染CARD9－／－鼠生存時(shí)間的關(guān)鍵。中性粒細(xì)胞在肺部積累的程度與疾病的嚴(yán)重程度平行，也證實(shí)中性粒細(xì)胞在疾病的致死性結(jié)果中起關(guān)鍵作用［4］。

在結(jié)核感染急性期，清除PMN或中和G－CSF有利于改善CARD9缺陷條件下粒細(xì)胞的病理功能。CARD9－／－鼠中，抗Gr－1抗體（淋巴細(xì)胞抗原6G抗體）的治療能影響Gr－1＋的單核細(xì)胞，延長(zhǎng)CARD9－／－鼠的存活時(shí)間。盡管除去PMN和減輕炎癥能延長(zhǎng)CARD9－／－鼠存活時(shí)間，但不能明顯影響肺部的細(xì)菌量，表明炎癥能夠單獨(dú)導(dǎo)致CARD9－／－鼠死亡。CARD9－／－鼠的巨噬細(xì)胞感染Mtb后，合成的一氧化氮（nitric oxide，NO）量 與 對(duì) 照 細(xì) 胞相同。在 體 內(nèi)，CARD9－／－鼠感染Mtb后，表達(dá)抗菌效應(yīng)分子的能力未被削弱，表明抗菌效應(yīng)分子不是導(dǎo)致CARD9－／－鼠對(duì) Mtb敏感度增加的原因。

3．大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的原因：Mtb感染的CARD9－／－鼠中，繼發(fā)壞死導(dǎo)致的間接損傷和MPO的系統(tǒng)釋放是影響小鼠生存的關(guān)鍵因素。中性粒細(xì)胞釋放壞死滲透酶和毒性因子，這些物質(zhì)損傷外周組織，而對(duì)Mtb沒(méi)有作用。粒細(xì)胞釋放的MPO對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，活動(dòng)性肺結(jié)核患者血中MPO水平增加［9］。

（二）CARD9缺陷影響Mtb感染的APC分泌細(xì)胞因子的能力

Mtb感染中，CARD9對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子起到至關(guān)重要的作用。用 Mtb感染 CARD9－／－的 BMDMs和DCs，這兩種細(xì)胞將病原體內(nèi)在化的能力和消除凋亡細(xì)胞的能力與對(duì)照細(xì)胞相比沒(méi)有削弱，但CARD9－／－的BMDMs合成前炎癥細(xì)胞因子TNF、白細(xì)胞介素－6（IL－6）和血清趨化因子5（CCL5）能力減弱，合成白細(xì)胞介素－12（IL－12）減少，釋放白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）缺陷［4］。CARD9能通過(guò)IL－1β的釋放環(huán)節(jié)影響其釋放，從而調(diào)節(jié)炎癥。低水平IL－1β誘導(dǎo)遲發(fā)中性粒細(xì)胞反應(yīng)［10］。TNF合成減少與肉芽腫形成減少有關(guān)［11］。CARD9缺陷減少轉(zhuǎn)錄因子 NK－κB的核移位［12］，趨化因子CXCL2（MIP－2）的啟動(dòng)子含有 NF－κB的結(jié)合部位［13］，使得 MIP－2合成下調(diào)。IL－6合成的減少能直接減少趨化因子CXCL1（KC）的合成。

（三）CARD9缺陷影響宿主固有免疫，而非獲得性免疫

檢測(cè)Mtb感染CARD9－／－鼠肺部T細(xì)胞亞群、CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的比例，以及T細(xì)胞功能，CARD9－／－鼠與對(duì)照鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩者對(duì)Mtb產(chǎn)生相同程度的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并且卡介苗誘發(fā)的保護(hù)性免疫相同，T淋巴細(xì)胞合成的細(xì)胞因子量一致。因此，獲得性免疫不受CARD9缺陷影響［4］。

CARD9的缺陷不影響T細(xì)胞對(duì) Mtb的反應(yīng)。CARD9－／－鼠在感染Mtb后，體內(nèi)Th1反應(yīng)正常。細(xì)菌表面布滿(mǎn)各種PAMPs，這些分子模式同時(shí)激活多種PRRs，Mtb被多種受體識(shí)別并不受單一受體配體反應(yīng)的限制。因此，盡管Syk－CARD9途徑參與合成IL－17的CD4＋T細(xì)胞的分化，Th17對(duì)Mtb的應(yīng)答沒(méi)有任何缺陷。結(jié)核亞單位疫苗佐劑核心因子正6，6－二霉菌酸海藻糖（索因子）［trehalose－6，6′－dimycolate（cord－factor），TDM］和其合成類(lèi)似物6，6－二十二酸酯海藻糖（trehalose－6，6′－dibehenate，TDB）依賴(lài) 于 MINCLE 和Syk－CARD9信號(hào)途徑活化巨噬細(xì)胞，通過(guò)固有免疫發(fā)揮佐劑活性［14－15］。盡管獲得性免疫未受到影響，CARD9－／－鼠仍然存在嚴(yán)重的固有免疫缺陷。CARD9缺陷的條件下，炎癥得不到控制。

結(jié)論與展望

Mtb或疫苗進(jìn)入人體，與APC相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞因子，誘導(dǎo)人體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度與患者的預(yù)后密切相關(guān)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的相關(guān)分子機(jī)制倍受關(guān)注。固有免疫細(xì)胞活化及其細(xì)胞因子的分泌是決定機(jī)體免疫應(yīng)答重要而關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。對(duì)APC的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其關(guān)鍵信號(hào)分子的研究具有重要意義。

作為多種受體的中心分子，CARD9在調(diào)節(jié)宿主抗結(jié)核感染的固有免疫中發(fā)揮重要作用。在體外，銜接分子CARD9缺陷削弱Mtb感染APC合成、分泌細(xì)胞因子的能力。在體內(nèi)，CARD9－／－鼠出現(xiàn)以大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺部過(guò)度炎癥為特征的病理表現(xiàn)。Dectin－1、NOD和 Mincle等受體均可通過(guò)銜接分子CARD9傳遞信號(hào)，這增加了宿主的脆弱性。探討Mtb感染后宿主免疫細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及其關(guān)鍵分子的作用機(jī)制和CARD9多態(tài)性與宿主對(duì)Mtb易感性間的關(guān)系有助于深入理解結(jié)核病患者的發(fā)病、病程和預(yù)后，為患者制定個(gè)性化的治療方案。

目前，臨床主要進(jìn)行Mtb及其耐藥性的檢測(cè)工作，缺少患者機(jī)體免疫對(duì)病程和預(yù)后影響的相關(guān)指標(biāo)。通過(guò)對(duì)CARD9在抗結(jié)核免疫中作用機(jī)制的探討，可以找到影響患者預(yù)后的免疫指標(biāo)，并采取相應(yīng)治療措施，改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)患者生命。此外，CARD9在結(jié)核亞單位疫苗佐劑發(fā)揮活性中起到重要作用，對(duì)CARD9的研究可為開(kāi)發(fā)結(jié)核疫苗奠定相關(guān)的基礎(chǔ)。

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