植物多倍體育種的探討

張紅亮，朱永琴，李 霞，姚先玲

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，山西 太原 030006）

植物界中的多倍體極為常見。多倍體是高等植物染色體進化的顯著特征，小麥、煙草、棉花、馬鈴薯、甘蔗等都是自然形成的多倍體。其產(chǎn)生途徑可分為有性多倍化和無性多倍化，有性多倍化為植株在有性生殖過程中其小孢子母細胞或大孢子母細胞在減數(shù)分裂過程中不減數(shù)產(chǎn)生了2n配子，無性多倍化為植株在體細胞分裂過程中發(fā)生染色體加倍，而有性多倍化是自然界多倍體形成的主要方式。采用染色體加倍的方法選育植物新品種的途徑稱為多倍體育種，為倍性育種的一種方式。誘導產(chǎn)生植物多倍體的途徑主要有物理誘導法和化學誘導法，而對多倍體的鑒定方法也呈多樣化，對相關(guān)知識技術(shù)的了解，可對多倍體育種實踐起到推動和促進作用。

1 物理誘導法

1.1 栽培技術(shù)法

在育種研究實踐中，育種者常采用田間栽培措施來形成多倍體。最早的物理誘導方式是在番茄上通過打頂而實現(xiàn)的。不過利用栽培技術(shù)來形成多倍體的方法效率低下，成效不大。

1.2 條件脅迫法

改變植物生長的外部環(huán)境，以使其內(nèi)部產(chǎn)生改變。如利用外界溫度變化（高溫、低溫、變溫處理）、干旱脅迫、水分脅迫處理等誘導產(chǎn)生2n花粉。有研究表明，利用高溫處理草木樨，可獲得多倍體植株；利用高溫或低溫處理授粉后的幼胚也可實現(xiàn)染色體的加倍。

1.3 輻照法

可采用電離射線、激變中子、離心力、激光等輻照以實現(xiàn)染色體加倍。用Co射線處理萌動的杜仲種子可以產(chǎn)生多倍體。已在月季、蘭花、菊花、大麗花等花卉中應(yīng)用輻射進行輻照育種，發(fā)現(xiàn)在花色、花型、株型上出現(xiàn)有利的變異。但因植物經(jīng)輻照后改變方向不固定，故導致存在效率低和不穩(wěn)定的缺點，故此法未能普及。

2 化學誘導法

常用秋水仙素、富民隆、生物堿、除草劑等化學藥劑處理正在分裂的細胞以誘導多倍體的產(chǎn)生，其誘導作用專一性強，其中以秋水仙素應(yīng)用最廣。秋水仙素主要作用對象為構(gòu)成紡錘絲的微管組織，秋水仙素抑制細胞分裂中紡錘絲的形成，從而使染色體不拉向兩極，導致赤道板上的染色體重新復(fù)制，最終使染色體加倍。主要有常規(guī)誘導法、離體培養(yǎng)誘導法和胚乳培養(yǎng)法等。

2.1 常規(guī)誘導法

2.1.1 浸泡法

首先可以浸種。將種子直接浸泡在一定濃度的溶液中作用一定時間，種子可在未發(fā)芽前或發(fā)芽后浸泡。其次可以浸根。浸根法已經(jīng)成功誘導出四倍體白菜等。浸泡時間可持續(xù)或間隔，其浸泡濃度不同，誘導效果不同。

2.1.2 生長點處理法

此法處理植株生長點的方式多樣，可涂抹、可滴注等。如可用1%的秋水仙素羊毛脂制劑滴或涂抹茄子幼苗生長點；還可以用注射器在蘿卜幼苗子葉期，用不同濃度秋水仙素點滴生長點進行誘變處理，均可誘導得到同源四倍體。此法需注意所用溶液濃度不可過高，否則植株會受害死亡。

2.1.3 花蕾處理法

此法可誘導出2n配子，選擇最佳誘導時期是其關(guān)鍵。如在白菜誘導上，在白菜抽薹期晴天早晨和下午處理花蕾，花蕾大小2.5～3.5 mm，秋水仙素處理濃度為0.05%、0.1%和0.2%。采用微量注射法，每個花蕾注射5～10 μL，每隔 6 h 處理 1 次，處理 1～3 次不等，誘導篩選出了含2n配子較高的二倍體材料。

2.2 離體培養(yǎng)誘導法

此方法把多倍體誘導與組織培養(yǎng)相結(jié)合，使得多倍體誘導中融入了組培的優(yōu)點。該方法目前已在白菜、萵苣等多種蔬菜和大巖桐、馬蹄蓮、虞美人等眾多花卉上取得成功。因所選的植物材料大多幼嫩，故處在分生狀態(tài)的組織細胞容易受秋水仙素的影響，誘導成功率較高，且可減少嵌合體。其次，由于組培是室內(nèi)進行的，試驗條件易于控制，這就在很大程度上降低了外界環(huán)境因素對于試驗的干擾和影響。再者，可一次誘導處理大批量的植物材料，更能對誘導成功的材料進行快繁，獲得更多的多倍體材料，故大大加快了育種進程，育種效率較高。

2.3 胚乳培養(yǎng)法

胚乳是天然的三倍體組織，因此，胚乳培養(yǎng)可直接獲得三倍體植株。胚乳培養(yǎng)目前主要應(yīng)用在果樹、蔬菜、水果和糧食作物中，如獼猴桃、白桑等可直接進行胚乳培養(yǎng)；吳清等以紅楊桃成熟干種子為材料，萌發(fā)后剝離胚乳進行培養(yǎng)得到的再生植株多數(shù)為三倍體，其誘變頻率超過70%。但胚乳培養(yǎng)在生產(chǎn)上應(yīng)用很少，其難點在于被子植物胚乳離體培養(yǎng)通常很難誘導和分化出苗。此外，胚乳愈傷組織在繼代培養(yǎng)中染色體數(shù)目常表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，再生植株多為非整倍體、混倍體，增加了育種及篩選難度，增加了工作量。

3 鑒定方法

主要有田間觀測鑒定法、實驗室鑒定法和條件脅迫鑒定法等。

3.1 田間觀測鑒定法

即根據(jù)植株外部形態(tài)特征表現(xiàn)，在田間進行直接觀測，篩選多倍體。實踐中，主要從葉片特征（葉片形態(tài)、葉片大小、葉片厚度等）及花朵特征（花朵大小、花瓣厚度等）等方面著手鑒定。研究可知，四倍體黃瓜葉片面積比二倍體大，且葉片變厚，葉緣皺褶明顯，葉色加深。四倍體三色堇花朵巨大，花色艷麗，花斑變大，使其較二倍體三色堇觀賞價值有較大的提升。而且不同倍性植株其植株高度、開花期、結(jié)實期往往不同，其莢果大小、種子重量及大小往往也有差異，也可從這些方面著手鑒定。

3.2 實驗室鑒定法

即在實驗室里，試驗人員按照一定的試驗程序，采用一定的儀器設(shè)備，運用一定的試驗技術(shù)，對疑似多倍體進行篩選，以確認多倍體的方法。

3.2.1 顯微鏡觀測法

主要觀測葉片保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目的特征及葉片氣孔特征。四倍體較二倍體葉片保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目增加，單個葉片氣孔增大。這在香蕉、蘿卜等植物上都得到了證實。還可對花粉粒進行大小測量，找出區(qū)別，以鑒定多倍體。如蘿卜四倍體花粉粒較二倍體花粉粒的橫徑、縱徑明顯變大，且有不規(guī)則形狀出現(xiàn)，如圓形；而二倍體蘿卜的花粉粒全為規(guī)則狀，均為狹長型。

3.2.2 染色體鑒定法

主要有根尖染色體制片法及流式細胞儀鑒定法等。其中染色體制片法因可直接見每條染色體的大小、形態(tài)及染色體數(shù)目，故為倍性鑒定最可靠、最直接的方法，應(yīng)用廣泛。而流式細胞術(shù)測量快速，可對細胞倍性進行精確分析，尤其應(yīng)用于嵌合體的檢測上，現(xiàn)在已成功地應(yīng)用于蘿卜、蘋果、獼猴桃、李子、番茄等植物上。

3.3 條件脅迫鑒定法

其原理為利用不同倍性的植物因其內(nèi)部基因組數(shù)的不同，故在同一脅迫條件下，其對外界脅迫的反應(yīng)不同，植株表現(xiàn)出一定的生理生化變化，據(jù)此進行鑒定。常有溫度脅迫（高溫脅迫、低溫脅迫）、水分脅迫、鹽分脅迫、凍害脅迫、冷害脅迫等。有研究者利用高溫和低溫脅迫對二倍體西瓜和四倍體西瓜進行了鑒定，且符合程度均高于80%。

4 討論

4.1 誘導方法

要明確，處理時間因處理方法的不同則不同。誘導多倍體植物其方法具有多樣性，而且針對不同的植物生長階段和不同部位又有其獨特性。如0.1%～0.3%濃度的秋水仙素均可誘變獲得四倍體蘿卜，隨著秋水仙素濃度的增高，總變異株率升高，但植株受傷害程度也加大，導致成活率降低?？梢娭仓甑奶囟ú课淮嬖谝粋€對藥劑濃度耐受極限和最適誘導濃度的問題，這需要科研工作者在科研育種實踐中進行試驗實踐探索，以期有所收獲。

4.2 鑒定方法

田間形態(tài)鑒定法較易掌握，且簡單易行，選擇速度快，可以在育種初始選擇時應(yīng)用；而顯微鏡觀測法、根尖染色體制片法、流式細胞儀鑒定法等實驗室鑒定法則需要一定的實驗人員、實驗條件及經(jīng)費支持，可以在初始選擇后需進一步確認篩選時應(yīng)用；而條件脅迫鑒定法所用時間較長，在實際育種中應(yīng)用不多。故在育種實踐中，要根據(jù)植物的特點及其所處的獨特生長階段及實驗室試驗條件、人員條件和經(jīng)濟因素等方面綜合考慮，以尋求最經(jīng)濟高效的鑒定方法。同時也要注意，鑒定方法的劃分并非絕對化，而是不能截然分開的，它們之間是有聯(lián)系的。如根尖染色體制片法中也需用顯微鏡鏡檢和照相。育種過程是各種方法靈活綜合應(yīng)用的過程，而隨著科學技術(shù)的發(fā)展，還會有新的鑒定方法出現(xiàn)，如實驗室鑒定法又出現(xiàn)了同工酶鑒定法。有研究者經(jīng)西瓜試驗指出，一般表現(xiàn)為隨倍性的增加，同工酶活性減低。

4.3 穩(wěn)定性

誘導易發(fā)生嵌合體現(xiàn)象，如沒有經(jīng)過穩(wěn)定的三色堇變異株移栽大田后卻表現(xiàn)嵌合體的性狀。對于嵌合體可采用定向選擇的方法來穩(wěn)定四倍體。如可采用分部位、分類別分生繁殖（扦插、嫁接、分別收獲有最大變異植株種子和中等變異植株的種子等）的方法來進行逐步選擇。育種的中心環(huán)節(jié)是選擇，故可以在大的多倍體群體上進行有效選擇，看其長期表現(xiàn)，以得到穩(wěn)定的多倍體。另外，離體組織細胞染色體加倍可減少嵌合體。而流式細胞術(shù)可以針對嵌合體進行定量分析，有助加快嵌合體群體的篩選速度。

4.4 低稔性

剛誘導成功的四倍體其孕性是很低的，這在四倍體蘿卜、四倍體白菜中得到了證實。研究者發(fā)現(xiàn)，采用適當?shù)挠N方法如混合選種、品種間雜交等措施也可使四倍體西瓜孕性提高。而在栽培措施管理上，可以在開花結(jié)實期適度減少氮肥的施用，以抑制植株營養(yǎng)器官的生長，而采用增施磷、鉀、鎂、硼等微量元素，以保證植株生殖器官的營養(yǎng)，促進同化物質(zhì)由營養(yǎng)器官向生殖器官的集中運轉(zhuǎn)，從而可以提高孕性。

4.5 多倍體育種的獨特優(yōu)勢

其一，多倍體育種可作為育種媒介和橋梁，把不能直接雜交的奇數(shù)倍植株加倍后變?yōu)榭梢赃M行雜交的材料。其二，多倍體育種的最終成品往往在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性上較低倍體高出許多，故為以品質(zhì)、抗性、產(chǎn)量為育種目標的育種項目提供了一條相對便捷的道路。其三，多倍體育種在花卉育種上獨占優(yōu)勢。因多倍體往往表現(xiàn)為巨大性，而花卉的花瓣為其主要觀賞部位，若能增加花瓣大小，則能取得更好的觀賞效果，較花卉上其他的育種方法更占優(yōu)勢。故可使觀賞植物的微觀之美放大，使近觀為美變?yōu)檫h觀為美，如可以設(shè)想未來枸杞大型花朵的遠觀之美。

4.6 育種方法的綜合運用

育種分為常規(guī)育種及非常規(guī)育種法，需要在育種過程中把二者有機結(jié)合起來。育種不是孤立的過程，可把雜交育種、系選法、遠緣雜交等常規(guī)育種方法與分子育種、轉(zhuǎn)基因育種、多倍體育種、輻射育種、分子標記等非常規(guī)育種方法相結(jié)合，針對實際情況，進行分階段的選擇性應(yīng)用，靈活性應(yīng)用，以期達到設(shè)定的預(yù)期育種目的。

4.7 前景展望

當前，多倍體育種已經(jīng)在世界各國進行了廣泛的研究應(yīng)用，其涉及到的植物種類眾多。植物的多倍體育種可以高效率地改變植物的某些性狀，如通過多倍體的巨大性提高產(chǎn)量等，尤其在蔬菜植物及花卉中廣泛應(yīng)用。如已在黃瓜、西瓜、白菜、香蕉、三色堇、蘭花、菊花、大麗花等園藝植物上有研究，提高了蔬菜和花卉的品質(zhì)。如獲得的同源四倍體蘿卜，其直根維生素C、可溶性蛋白、可溶性糖、還原糖等含量較二倍體提高，而粗纖維和干物質(zhì)含量降低，營養(yǎng)品質(zhì)明顯改善。也可提高花卉的耐貯運的能力，如四倍體麝香百合花瓣厚實，較二倍體耐貯運。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，我們有理由相信植物多倍體育種其技術(shù)路線會更加成熟完善，其誘導方法、鑒定方法很可能會有突破性的進展，會創(chuàng)制出更多的優(yōu)良種質(zhì)資源及優(yōu)良品種，以更好地服務(wù)于育種實踐及生產(chǎn)實踐。