超聲微泡造影劑與胰腺癌靶向診斷和治療的研究進(jìn)展

徐心純 成建萍 周國雄

超聲微泡造影劑與胰腺癌靶向診斷和治療的研究進(jìn)展

徐心純 成建萍 周國雄

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，預(yù)后很差，其病因考慮與大量吸煙、糖尿病、慢性胰腺炎、肥胖、基因突變等有關(guān)[1]。因胰腺癌起病隱匿，且早期癥狀不明顯，使大多數(shù)患者失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，即使將腫瘤切除，術(shù)后極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。胰腺癌分子靶向治療是近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。超聲微泡造影劑是一種新的安全有效的載體，可從分子水平上介導(dǎo)腫瘤的靶向診斷和治療。

一、靶向超聲微泡的研究進(jìn)展

超聲微泡由外殼和內(nèi)充氣體兩部分組成。內(nèi)充氣體在超聲波作用下產(chǎn)生非線性回聲，從而可實(shí)現(xiàn)微泡的超聲下顯影，由于其具有較強(qiáng)的回波反射性能，因此被認(rèn)為是目前最好的人體微血管內(nèi)造影材料。目前研究的第三代超聲微泡造影劑的直徑1～8 μm，采用脂質(zhì)、白蛋白、表面活性劑或高分子多聚物作為外殼，它能在血管腔中保持相對(duì)穩(wěn)定并可以順利通過肺循環(huán)[2]，實(shí)現(xiàn)全身器官組織、病變回聲增強(qiáng)從而提高組織顯影的清晰度[3]。

普通微泡造影劑因缺乏對(duì)病變組織的特殊親和力，不能有效駐留靶組織，為此人們開始研究具有特異性的靶向超聲微泡。靶向超聲造影劑不再需要白細(xì)胞的介導(dǎo)，而是將特異性抗體或配體連接到聲學(xué)造影劑表面，依靠抗原-抗體或配體-受體之間的特異性結(jié)合，通過血液循環(huán)積聚到特異的靶器官或靶組織，從而使器官或組織在超聲影像中得到特異性的增強(qiáng)或局部靶向治療作用[4]。與普通微泡相比，靶向超聲微泡通過免疫反應(yīng)或生物反應(yīng)，從分子水平識(shí)別并結(jié)合于病變部位，避免了吞噬細(xì)胞對(duì)微泡的破壞，因而具有高度的特異性和靶向性。

二、靶向超聲微泡產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制

造影劑超聲微泡的生物學(xué)特性使其成為一種理想的基因或藥物遞送載體。將少量攜帶基因或藥物的微泡經(jīng)外周靜脈或局部注射后,微泡流經(jīng)靶向部位時(shí)進(jìn)行超聲,即得到超聲影像[5]。當(dāng)超聲影像圖證明超聲準(zhǔn)確定位于靶向部位時(shí),增加聲壓使之達(dá)到一定強(qiáng)度,即可使微泡破裂產(chǎn)生空化效應(yīng)[6]。空化效應(yīng)是指液態(tài)中的微小氣泡在超聲的激發(fā)下，氣泡不斷振動(dòng)、膨脹、收縮以致破裂的動(dòng)力學(xué)過程，包括低強(qiáng)度超聲場作用下引發(fā)的微射流及輻射壓力的穩(wěn)態(tài)空化和高強(qiáng)度超聲下微泡急劇膨脹收縮引起微泡爆裂的瞬態(tài)空化，此過程中瞬間釋放大量聲能，使局部產(chǎn)生高溫、高壓，隨之產(chǎn)生光效應(yīng)和氧自由基等二次效應(yīng),使微血管破裂 ,血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增寬，微血管壁的通透性增大。1997年Bao使用低聲壓(0.2 MPa)超聲波對(duì)含微泡的大田鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行輻照，細(xì)胞膜就可以對(duì)大分子暫時(shí)開放，爾后再封閉起來。在細(xì)胞膜暫時(shí)開放期間，細(xì)胞外的大分子即可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞捕獲，并稱此現(xiàn)象為聲孔效應(yīng)[7]。聲孔效應(yīng)可使細(xì)胞出現(xiàn)“永久”或“暫時(shí)”的微孔(與微泡劑濃度和超聲劑量有關(guān))，從而導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，毛細(xì)血管損傷等。這些現(xiàn)象有利于靶向超聲微泡所攜帶的抗腫瘤物質(zhì)進(jìn)入血管腔隙，從而進(jìn)一步提高微泡對(duì)腫瘤的靶向診斷和治療作用。

三、靶向超聲微泡在胰腺癌診斷和治療中的應(yīng)用進(jìn)展

1．超聲微泡用于胰腺癌的診斷：超聲微泡造影劑的成像技術(shù)原理主要是利用聲波對(duì)氣體反射比液體大近1000倍的原理及微泡的非線性聲學(xué)效應(yīng)，通過聲衰減、聲速的改變和增強(qiáng)后散射等方式改變聲波與組織間的吸收、反射和折射等相互作用，使超聲回聲增強(qiáng)，從而提高灰階成像的對(duì)比分辨率和空間分辨率，達(dá)到有利于診斷疾病的目的。二維、彩色多普勒超聲及能量多普勒超聲能對(duì)較大的胰腺癌病灶進(jìn)行診斷，但對(duì)早期小的胰腺癌病灶且分散的病灶存在困難。超聲微泡造影對(duì)血液回聲的增強(qiáng)，彌補(bǔ)了多普勒對(duì)不典型腫瘤及腫瘤中低速低流量血管的顯示不良，可充分顯示腫瘤新生血管網(wǎng)。

國內(nèi)外有關(guān)靶向超聲微泡在胰腺腫瘤方面的研究和報(bào)道逐漸增多，已顯示出巨大前景。Linder等[8]研究表明，靶向微泡可用于腫瘤血管和組織的顯影。靜脈注射Levovist后可觀察到小血管內(nèi)的低速血流，從而獲得較造影前更豐富的血流信息，且病灶內(nèi)多普勒信號(hào)強(qiáng)度的最大值和平均值較造影前有明顯增強(qiáng)。徐慧等[9]對(duì)42例胰腺占位性病變患者進(jìn)行的即時(shí)超聲微泡造影檢查顯示惡性病變、良性病變與實(shí)質(zhì)灌注(包括灌注早期、灌注晚期)3組間的造影劑始增時(shí)間、始- 峰時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D′Onofrio等[10]研究了超聲造影檢查及CT增強(qiáng)檢查，在對(duì)43例患者進(jìn)行術(shù)后病理微血管密度檢查后發(fā)現(xiàn)，超聲造影檢查所提示的胰腺腫瘤類別與病理結(jié)果相關(guān)指數(shù)很高(OR=0.914)，而增強(qiáng)CT檢查結(jié)果與病理結(jié)果的OR僅為0.635，因此超聲造影能更好地反映胰腺腫瘤內(nèi)部的血管分布。Hocke等[11]收集86例病例進(jìn)行超聲微泡對(duì)局灶性胰腺炎與胰腺癌鑒別診斷價(jià)值的研究，其中胰腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：常規(guī)能量多普勒檢查未見血流信號(hào)，而在使用超聲微泡后有較短動(dòng)脈顯影，但整個(gè)造影增強(qiáng)過程均未見靜脈血流信號(hào)顯示。利用微泡可有效改善超聲對(duì)腫瘤血管的檢測、更準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腫瘤血管，提高了胰腺良、惡性腫瘤的診斷及鑒別診斷水平，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和臨床意義。

2．超聲微泡用于胰腺癌的治療：目前研究微泡主要通過作為藥物及基因的載體和介導(dǎo)血管栓塞兩方面發(fā)揮腫瘤治療作用。微泡攜帶藥物或基因可能有4種方法：(1)將藥物或基因黏附于微泡造影劑微殼中。(2)通過靜電作用，將帶電荷藥物或基因非共價(jià)結(jié)合到造影劑表面。(3)把藥物或基因整合入微泡內(nèi)部。(4)在造影劑外殼中形成一層油脂物質(zhì)包繞微泡，然后將疏水性藥物整合入這層油脂中。為使攜帶基因或藥物的超聲微泡造影劑具有靶向性，方法有[12]：(1)利用微泡本身外殼的化學(xué)和電荷特性使之滯留于病灶部位；(2)利用分子橋作用,將疾病相關(guān)的單克隆抗體與微泡結(jié)合，從而間接使微泡與病灶部位表達(dá)的相關(guān)抗原結(jié)合；(3)在微泡表面連接特異性抗體或配體,使之結(jié)合到病灶部位細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原或受體上，達(dá)到靶向性顯影和治療的目的。

目前研究較為廣泛的是將特異性好、活性高的配體或抗體牢固連接到微泡表面，這也是制備靶向微泡的關(guān)鍵技術(shù)所在。超聲微泡介導(dǎo)的腫瘤靶向治療有低免疫原性、低毒性、低侵襲性、無創(chuàng)、器官組織特異性、可重復(fù)應(yīng)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為各種疾病治療手段中具有潛力的新技術(shù)。將攜帶基因或細(xì)胞毒性藥物的靶向微泡從外周靜脈或局部注射，當(dāng)微泡特異性結(jié)合到腫瘤部位時(shí)，進(jìn)行超聲輻照破壞微泡，使基因或藥物局部釋放，達(dá)到提高局部藥物或基因的濃度、避免藥物被肝臟攝取、延緩藥物的釋放、減少給藥次數(shù)、減小給藥劑量、增加藥物療效[13]和減輕全身不良反應(yīng)的目的，而且還可以通過改變超聲儀器各個(gè)參數(shù)的設(shè)置，控制藥物釋放速度，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，減少藥物或基因破壞，節(jié)約用量。

紫杉醇是目前臨床治療腫瘤的常用化療藥物，也是目前最有前景的廣譜抗癌藥物之一。紫杉醇類藥物能促進(jìn)微管聚合，同時(shí)抑制其解聚，使微管束排列異常，從而使紡錘體失去其正常功能，細(xì)胞有絲分裂停止。楊健等[14]發(fā)現(xiàn)多烯紫杉醇對(duì)人胰腺癌BxPC3細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用，載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡聯(lián)合靶向超聲微泡破裂技術(shù)能明顯降低BxPC3細(xì)胞的S期細(xì)胞比例和細(xì)胞增殖指數(shù)，使腫瘤細(xì)胞活性顯著降低，同時(shí)能增強(qiáng)對(duì)BxPC3細(xì)胞的G2/M期阻滯作用，提高BxPC3細(xì)胞凋亡率。楊春江等[15]對(duì)載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡體內(nèi)外毒性實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠直接注射紫杉醇后會(huì)出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，大劑量注射后急性中毒反應(yīng)會(huì)更加嚴(yán)重，而注射載紫杉醇脂質(zhì)微泡后僅有少數(shù)出現(xiàn)輕微反應(yīng)，大部分小鼠無任何反應(yīng)。由此可見，超聲微泡作為載體顯著降低了紫杉醇因受劑型約束而產(chǎn)生的不良作用，且經(jīng)一定能量超聲輻照后，所載紫杉醇仍能保持較強(qiáng)的抗腫瘤活性。劉瑤等[16]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫杉醇可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，但經(jīng)超聲輻照載紫杉醇的微泡造影劑后腫瘤細(xì)胞的凋亡率更高，且隨著時(shí)間的延長對(duì)胰腺癌的抑制作用也增強(qiáng)。10-羥基喜樹堿與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，所需藥物劑量低，但其穩(wěn)定性和水溶性差，半衰期短。嚴(yán)思靜等[17]成功制備了載10-羥基喜樹堿脂質(zhì)超聲微泡，將10-羥基喜樹堿包裹于磷酯雙分子層的壁上，解決了以上難題，且提高了藥物包封率，經(jīng)超聲輻照后藥物釋放量增加，為后期的腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。Rapoport等[18]制備的變相型多功能納米粒子，首先以納米級(jí)微球的形式攜帶抗癌藥物穿過血管內(nèi)皮達(dá)到腫瘤組織，然后內(nèi)部的全氟戊烷氣化轉(zhuǎn)變?yōu)檩d藥微泡，經(jīng)超聲輻照后會(huì)更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。

四、前景和展望

超聲微泡介導(dǎo)的藥物治療方法提高了靶向性，降低了藥物的不良反應(yīng)，這將會(huì)成為胰腺癌診斷和治療的新途徑。但目前需要解決的問題包括：(1)構(gòu)建更小、穩(wěn)定性更好、更安全的微泡；(2)使有組織特異性的抗原、藥物更高效牢固地結(jié)合在微泡表面；(3)超聲破壞微泡對(duì)周圍組織產(chǎn)生一定的有害效應(yīng)，要將這一技術(shù)應(yīng)用于臨床，還要對(duì)微泡劑量、濃度和超聲輻照參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其盡量與診斷超聲的條件相一致，提高對(duì)人體的安全性?？偟膩碚f，靶向超聲微泡在胰腺癌診斷和治療的基礎(chǔ)和臨床研究向人們展示出了美好的前景，可以預(yù)測，隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，該技術(shù)將為胰腺癌診斷和治療提供全新的手段。

[1] Loos M,Kleeff J,Friess H,et al.Surgical treatment of pancreatic cancer.Ann N Y Acad Sci, 2008,1138:169-180.

[2] Rasisinghani A,DeMaria AN.Physical principles of microbubble ultrasound contrast agents.Am J Cardiol,2002,90:3J-7J.

[3] ter Haar GR.Ultrasonic contrast agents:safty considerations reviewed.Eur J Radiol,2002,41:217-221.

[4] Klibanov AL.Microbubble contrast agents:targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.Invest Radiol,2006,41:354-362.

[5] Zhao YZ,Liang HD,Mei XG,et al.Preparation,characterization and in vivo observation of phospholipid-based gasfilled microbubbles containing hirudin.Ultrasound Med Biol,2005,31:1237-1243.

[6] Frenkel V.Ultrasound mediated delivery of drugs and genes to solid tumors.Adv Drug Deliv Rev,2008,60:1193-1208.

[7] Bao S,Thrall BD,Miller DL.Trasfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonopotation in vitro.Ultrasound Med Biol,1997,23:953-959.

[8] Linder JR,Song J,Christiansen J,et al.Ultrasound assessment of inflammation and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin.Circulation,2001,104:2107-2112.

[9] 徐慧，馮蕾.即時(shí)超聲微泡造影劑診斷胰腺占位性病變的價(jià)值.中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2011,19：650-654.

[10] D′Onofrio M,Malago R,Zamboni G,et al.Contrast-enhanced ultrasonography better indentifies pancreatic tumor vascularization than helical CT.Pancreatology,2005,5:398-402.

[11] Hocke M,Menges M,Topalidis T,et al.Contrast-enhanced endoscopic ultrasound in discrimination between benign and malignant mediastinal and abdominal lymphnodes nodes.J Cancer Res Clin Oncol,2008,134:473-480.

[12] Klibanov AL. Ligand-carrying gas-filled microbubbles:ultrasound conrtast aagents for targeted molecular imaging.Bioconjug Chem, 2005,16:9-17.

[13] Unger EC,Porter T,Culp W,et al.Therapeutic application of lipid-coated microbubbles.Adv Drug Deliv Rev,2004,56:1291-1314.

[14] 楊健，康娟，曾研，等.載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡增強(qiáng)人胰腺癌BxPC3細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32:618-621.

[15] 楊春江，王志剛，賴天霞，等.載紫杉醇脂質(zhì)微氣泡體內(nèi)外毒性試驗(yàn)研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2006,22：481-483.

[16] 劉瑤，康娟，吳小翎，等.載紫杉醇超聲微泡造影劑對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖影響及誘導(dǎo)凋亡作用研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2008,24：676-678.

[17] 嚴(yán)思靜，李攀，袁佩，等.載10-羥基喜樹堿脂質(zhì)超聲微泡的處方制備及一般特性研究.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2009,25：574-577.

[18] Rapoport N,Gao Z,Kennedy A.Multifuctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy, J NatI Cancer Inst,2007,99:1095-1106.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.021

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院

徐心純，Email:434658501@qq.com

2012-12-14)

(本文編輯：屠振興)