透明質(zhì)酸對聲帶瘢痕的預(yù)防作用△

甄瑞清 魏春生

聲帶特有的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能是發(fā)聲的基礎(chǔ)，當(dāng)各種原因損傷聲帶形成瘢痕時(shí)，往往會造成永久性的嗓音障礙。盡管臨床上應(yīng)用聲帶注射填充脂肪、筋膜等材料，以及應(yīng)用內(nèi)移性甲狀軟骨成形術(shù)，能夠部分提高發(fā)聲的聲強(qiáng)，改善發(fā)聲質(zhì)量;但均未涉及瘢痕本身的處理，總體療效也就欠佳。預(yù)防和治療聲帶瘢痕依舊是嗓音醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容和難點(diǎn)。近年來，學(xué)者們將瘢痕聲帶細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的修復(fù)和功能的重建作為研究的熱點(diǎn)。透明質(zhì)酸是聲帶細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，有著重要的生物學(xué)特性，在維持聲帶結(jié)構(gòu)、緩沖聲帶振動、預(yù)防及治療聲帶瘢痕中有著重要的作用。

1 透明質(zhì)酸的生物學(xué)特性

透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，由重復(fù)的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺二糖鏈組成的葡胺聚糖，分子量大(105～106)，具有聚集性、多孔性，有著重要的生物學(xué)意義［1］。在體內(nèi)，透明質(zhì)酸主要是在成纖維細(xì)胞中由透明質(zhì)酸合成酶合成。透明質(zhì)酸合成酶主要有3種亞型，位于細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)面，合成并向細(xì)胞外運(yùn)輸透明質(zhì)酸。不同亞型的透明質(zhì)酸合成酶產(chǎn)生不同分子量的透明質(zhì)酸。高分子量的透明質(zhì)酸，主要是由透明質(zhì)酸合成酶1和透明質(zhì)酸合成酶2產(chǎn)生，在抑制細(xì)胞分化和細(xì)胞黏附中起重要作用;低分子量的透明質(zhì)酸，主要是由透明質(zhì)酸合成酶3產(chǎn)生，在啟動信號串聯(lián)、刺激細(xì)胞分化、血管生成、炎癥中起重要作用［2］。

透明質(zhì)酸在體內(nèi)與透明質(zhì)酸受體相結(jié)合后，在細(xì)胞集聚、細(xì)胞-基質(zhì)信號傳導(dǎo)、基質(zhì)-細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移中起著重要的作用［2-3］。透明質(zhì)酸的降解，也主要是通過與透明質(zhì)酸的受體(CD44和透明質(zhì)酸介導(dǎo)的能動受體)結(jié)合后，形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞，在溶酶體酶的作用下，由透明質(zhì)酸酶分解成葡萄糖醛酸和乙酰葡萄糖胺。

2 透明質(zhì)酸在聲帶的分布及其生理作用

透明質(zhì)酸在聲帶中主要分布在固有層，其含量隨年齡變化不大，約占0.82%［4］，其中以固有層的中層最為豐富［5-6］。也有文獻(xiàn)［2］報(bào)道透明質(zhì)酸的分布存在性別的差異，在固有層淺層，透明質(zhì)酸含量女性較男性少;在固有層中深層，透明質(zhì)酸含量女性高于男性。

透明質(zhì)酸在聲帶細(xì)胞外基質(zhì)中形成高度極化鏈，適合連接水分子，增加細(xì)胞外基質(zhì)中水及離子的含量，從而增加總?cè)萘?，其體積可擴(kuò)增至原來的1000倍，對組織的黏滯性、流動性、滲透壓、濕度和組織間隙的填充起主要作用。透明質(zhì)酸濃度越高，組織黏滯性越高，緩沖能力也越強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn):去除聲帶組織內(nèi)的透明質(zhì)酸后，其彈性剪切系數(shù)平均下降了25% ～40%，動態(tài)黏滯度提高了70%［5］;最近也有研究［7］驗(yàn)證了透明質(zhì)酸與聲帶的粘度和彈性剪切力有著相關(guān)性。由此可見:透明質(zhì)酸有利于維持聲帶發(fā)聲的最佳組織粘度和控制嗓音基頻的最佳組織僵硬度。

此外，研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸對維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡和聲帶成熟、分化有很重要的作用。透明質(zhì)酸可與其它細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響膠原的大小和密度，保護(hù)糖蛋白不被降解，從而維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。透明質(zhì)酸對聲帶成熟、分化的作用可以通過透明質(zhì)酸受體CD44的表達(dá)來證明:從未發(fā)聲的聲帶的透明質(zhì)酸量要比正常發(fā)聲的聲帶低［8］。

近來，研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸在聲帶瘢痕的預(yù)防、減少形成和治療中也起著重要的作用［9］。

3 聲帶損傷后透明質(zhì)酸量的變化

外傷、用聲過度、插管、咽喉反流、化學(xué)刺激以及手術(shù)操作不當(dāng)均可導(dǎo)致聲帶損傷，致使聲帶固有層內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的分布及含量發(fā)生變化［10］。聲帶細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分主要包括纖維蛋白和間隙蛋白，其中組成纖維蛋白的膠原纖維和彈力纖維，與聲帶組織的張力和柔韌性有關(guān);組成間隙蛋白的蛋白多糖和黏多糖，參與影響聲帶的僵硬度和黏滯度［11］。聲帶細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分恰恰具有易于鑒定的特點(diǎn)，因此國內(nèi)外學(xué)者紛紛將其作為觀察及研究的對象。其中，間隙蛋白中的透明質(zhì)酸(蛋白多糖)與纖維蛋白中的膠原蛋白、纖維連接蛋白(糖蛋白)為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)，對于反映聲帶內(nèi)總體細(xì)胞外基質(zhì)的變化具有一定的代表性。目前，國內(nèi)外對聲帶損傷后細(xì)胞外基質(zhì)的研究主要包括:損傷后早中期的研究，觀察時(shí)間多數(shù)在3 d～3個(gè)月內(nèi);對聲帶損傷中后期的研究，觀察時(shí)間為損傷后2～6個(gè)月;也有對聲帶損傷連續(xù)性的研究，觀察時(shí)間為損傷后3 d～12 個(gè)月［12］。

國內(nèi)外學(xué)者對不同動物模型做了不同時(shí)間段的觀察研究，透明質(zhì)酸在聲帶損傷后有著不同的變化。Thibeault等［13］對兔的研究發(fā)現(xiàn):在聲帶損傷后3、5、10、15 d，實(shí)驗(yàn)組透明質(zhì)酸的量與正常組相比下降。徐文等［12］也對兔的具體研究發(fā)現(xiàn):透明質(zhì)酸在正常對照組主要分布于固有層淺層及中層，損傷后3～15 d分布至固有層各層，含量略有增加，損傷后40 d～3個(gè)月分布于固有層淺層及中層，含量與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，損傷后6～12個(gè)月分布與含量接近正常對照組。Tateya等［14］研究發(fā)現(xiàn):大鼠在聲帶損傷后2～12周中，損傷組與正常組相比，透明質(zhì)酸的量明顯降低。Rousseau等［15］在內(nèi)鏡下用顯微剪將犬聲帶固有層與肌層銳性分離，分別于術(shù)后2、6個(gè)月時(shí)觀察聲帶內(nèi)膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后2、6個(gè)月透明質(zhì)酸的含量與對照組無顯著性差異。Hirano等［16］對早期聲門癌激光治療后的聲帶活檢研究發(fā)現(xiàn):透明質(zhì)酸的量是降低的，甚至有透明質(zhì)酸的缺失。

4 對聲帶瘢痕的預(yù)防和治療作用

學(xué)者對損傷聲帶研究發(fā)現(xiàn)，在聲帶損傷的早、中期，以膠原為主的纖維組織會持續(xù)增生和無序排列、透明質(zhì)酸少量增多以及纖維連接蛋白顯著增生;到了后期，各種細(xì)胞外基質(zhì)分泌減少，但膠原和纖維連接蛋白的含量仍明顯高于正常，聲帶固有層局部的細(xì)胞外基質(zhì)以紊亂沉積的膠原為主，無分層結(jié)構(gòu)，伴組織重塑、瘢痕形成［12］。

研究［9］發(fā)現(xiàn)，與成人相比，胎兒在聲帶損傷后往往無瘢痕形成，其原因發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸的含量在損傷后迅速增加，并能維持高含量的狀態(tài)。早期透明質(zhì)酸持續(xù)的含量增高能夠抑制損傷后膠原的無序沉積(具體機(jī)制尚不清楚)，促進(jìn)聲帶固有層的修復(fù)及重塑，為聲帶的修復(fù)再生創(chuàng)造良好的環(huán)境。徐文等［12］認(rèn)為在聲帶損傷后15 d內(nèi)增加聲帶透明質(zhì)酸含量有可能使膠原沉積的情況減輕，從而減少瘢痕形成。但是，在聲帶損傷的早期，聲帶自身分泌透明質(zhì)酸的能力是有限的;因此，如何增加透明質(zhì)酸的量也就成了各國學(xué)者研究的重要內(nèi)容?，F(xiàn)在，學(xué)者們增加透明質(zhì)酸量的方法主要有2種:一是直接注射植入透明質(zhì)酸;二是通過誘導(dǎo)增加透明質(zhì)酸的表達(dá)。

由于透明質(zhì)酸是一種多糖而不是蛋白質(zhì)，無抗原性、無毒性，又易于注射，可以作為填充材料［1］。但是，植入的透明質(zhì)酸在聲帶內(nèi)保持的時(shí)間短，在兔聲帶中大約持續(xù)1周［2，9］。為了既能保證透明質(zhì)酸的特性，又能延長其在聲帶中存在的時(shí)間。透明質(zhì)酸往往會與一些交聯(lián)物相交聯(lián)，其中1，4-丁二醇二縮水甘油醚(簡稱BDDE)和磺基二乙烯(簡稱DVS)是兩種最常見的交聯(lián)物，也有文獻(xiàn)報(bào)道了透明質(zhì)酸交聯(lián)的最適濃度在4% ～5%［2，9］。Hansen 等［17］在兔聲帶損傷后，立即將透明質(zhì)酸凝膠注射到聲帶中，3周后對其組織學(xué)和流變學(xué)觀察，證明透明質(zhì)酸有助于減少瘢痕的形成，起到了一定的預(yù)防作用。Thibeault等［18］同樣將一種名叫Extracel的透明質(zhì)酸凝膠注射到損傷的兔聲帶中，6個(gè)月后與對照組比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組原膠原等瘢痕成分的表達(dá)減少，聲帶的僵硬度也得到改善。Sahiner等［19］在損傷聲帶植入透明質(zhì)酸水凝膠交聯(lián)復(fù)合物后，聲帶組織學(xué)類似正常。由此可以看出，透明質(zhì)酸可以在一定程度上預(yù)防和減少聲帶瘢痕形成。

此外，通過一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)增加透明質(zhì)酸表達(dá)的作用，也可以促使自身透明質(zhì)酸生成增多，從而達(dá)到預(yù)防和減少瘢痕形成的目的。目前研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子有血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、上皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(TGF)等。Hirano等［20］對犬的聲帶瘢痕進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生透明質(zhì)酸并能減少I型膠原的產(chǎn)生。Luo等［21］也證明了肝細(xì)胞生長因子可以有效地刺激細(xì)胞對透明質(zhì)酸及彈力蛋白基因的表達(dá)，并有很強(qiáng)的抗纖維化活性，從而可以通過增加Reinke間隙中的透明質(zhì)酸、減少I型膠原的產(chǎn)生來防止或治療聲帶瘢痕;同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，多種細(xì)胞因子對聲帶瘢痕修復(fù)具有協(xié)同或者阻礙效用。Ohno等［22］等對犬聲帶損傷實(shí)驗(yàn)證明，TGF-β3也有助于增加透明質(zhì)酸的表達(dá)，從而預(yù)防減少瘢痕的形成。

當(dāng)瘢痕形成后，瘢痕收縮會使局部凹陷，會形成聲帶溝或弓形聲帶等，使聲帶黏膜的柔韌性受到影響，中斷了正常的黏膜振動功能，聲帶黏膜層和肌層相對機(jī)械運(yùn)動失調(diào)，使兩側(cè)聲帶的振動不規(guī)律，從而導(dǎo)致通過聲門的氣流紊亂，聲音變得矯飾、粗糙或出現(xiàn)復(fù)音;若聲門關(guān)閉不全，則會出現(xiàn)聲音低弱、發(fā)聲不能持久、易疲勞等發(fā)聲障礙［11］。透明質(zhì)酸此時(shí)作為填充劑注射植入，能在一定程度上改善聲帶的組織彈性，也可以用于治療瘢痕引起的聲門閉合不全。相比于特氟龍、明膠海綿、膠原和脂肪等移植填充材料，Chan等［5］發(fā)現(xiàn)0.5% ～1%濃度的透明質(zhì)酸彈性剪切特性與人聲帶黏膜相接近，提示了透明質(zhì)酸具有可以作為聲帶黏膜和固有層缺失修復(fù)的潛在價(jià)值。Hylan B Gel是目前研究最多的一種透明質(zhì)酸凝膠，是用磺基二乙烯(簡稱DVS)將透明質(zhì)酸分子經(jīng)過交叉聯(lián)接處理得到的。Jahan-Parwar等［23］對犬瘢痕形成的聲帶中注射植入 Hylan B Gel進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組比對照組有較好的黏膜波和較好的固有層恢復(fù)。Hylan B Gel不僅僅用于動物研究，在臨床治療上也有應(yīng)用研究。Hertegard和Hallen等［24］將Hylan B Gel和牛膠原相比較應(yīng)用于臨床治療聲門閉合不全，并對他們進(jìn)行了2年的隨訪。結(jié)果證明:二者用于聲帶注射均安全并無副作用，使患者聲門閉合改善，嗓音質(zhì)量明顯提高，然而Hylan B gel注射組聲帶形態(tài)更好、最大發(fā)聲時(shí)間更長，并且其吸收也比牛膠原少。由此可見，透明質(zhì)酸對已形成的聲帶瘢痕也有一定的治療作用。

5 展望

隨著研究的發(fā)現(xiàn)，單純透明質(zhì)酸植入損傷聲帶后，僅能早期在一定程度上模擬聲帶細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)，促進(jìn)聲帶固有層的修復(fù)和重塑，但作用時(shí)間和效果局限，對于促進(jìn)聲帶修復(fù)再生的能力有限［12，25］。近年來，隨著聲帶瘢痕組織工程學(xué)的發(fā)展，透明質(zhì)酸可用作支架與種子細(xì)胞(脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、自體肌肉干細(xì)胞等)形成三維空間復(fù)合物，發(fā)揮自身作用的同時(shí)，利用種子細(xì)胞的多向分化潛能和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，可以更好地促進(jìn)損傷聲帶的再生修復(fù)，從而達(dá)到預(yù)防減少瘢痕形成、治療瘢痕的目的。屆時(shí)，透明質(zhì)酸也將在聲帶瘢痕組織工程學(xué)中發(fā)揮更大的作用。

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