染色體制備及核型分析室內(nèi)質(zhì)控及其考評標準的探討

翁炳煥 任宇珂 朱瑞建 李文靜 沈敏 盧歡明 孫亞莉 潘玲 徐晨明

（浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 浙江省產(chǎn)前診斷中心，浙江 杭州 310006）

近年來，染色體核型分析已作為惟一的染色體病確診實驗項目而廣泛應(yīng)用于臨床及產(chǎn)前細胞遺傳學診斷。作為臨床實驗項目，均應(yīng)有規(guī)范的實驗室質(zhì)量控制方法［1-5］。室內(nèi)質(zhì)控是實驗室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是開展和做好室間質(zhì)評的前提和保障。

但該項目的室內(nèi)質(zhì)量控制方法至今尚未見國內(nèi)外文獻報道。本文參考相關(guān)文獻［6-8］，結(jié)合國內(nèi)外有關(guān)染色體分析室間質(zhì)評的文獻報道［9-13］，對該項目的室內(nèi)質(zhì)控方法提出探討，以提高染色體制備及核型分析的質(zhì)量。

1 標本采集與接種的室內(nèi)質(zhì)量控制

1.1 抗凝劑用量的控制 肝素過量會產(chǎn)生溶血或抑制淋巴細胞的轉(zhuǎn)化和分裂，肝素過少會使血液凝固，兩者均可使染色體分裂象減少。應(yīng)以0.1 ml肝素（125μ／ml）潤濕注射器抽取1 ml靜脈血為標準，為除去抗凝血漿中肝素對淋巴細胞生長的影響，可采用離心沉淀法或自然下沉法相對集中、分離淋巴細胞接種。

1.2 無菌操作過程的室內(nèi)質(zhì)控 在標本采集與細胞培養(yǎng)過程中必須嚴格無菌操作，吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，以防止殘留在吸管中的培養(yǎng)液焦化，將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。火焰消毒后的器材需適當冷卻后使用，以免燙死細胞。如果在鏡檢或肉眼觀察中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液混濁，疑有細菌時，可取少量培養(yǎng)物離心后，沉淀物涂片用革蘭染色油鏡檢查，判斷有無細菌，可據(jù)細菌鑒定及藥敏試驗選擇抗生素加入到培養(yǎng)基中，以有效抑制細菌生長。

1.3 影響淋巴細胞生長的因素 被檢標本中含有過高的免疫抑制劑、成人尤其是新生兒嚴重黃疸、高膽紅素血癥、嚴重溶血、敗血癥、細胞免疫水平低下、長期接受放療化療、服用其他不利于細胞生長的藥物或食物等均會影響細胞生長，使染色體分裂象減少。此類病例標本可相對分離淋巴細胞并以無菌生理鹽水洗滌后接種。

1.4 標本接種與處理過程的室內(nèi)質(zhì)控 外周血或臍血標本可根據(jù)白細胞數(shù)絕對含量多少決定接種血液量，有條件者可分離淋巴細胞后接種培養(yǎng)，或?qū)⒉裳樛驳尼樇庀蛏?，倒置?7℃數(shù)小時，待細胞自然下沉后，擠掉含有不利于淋巴細胞生長的肝素、免疫抑制劑等的上層血漿，或經(jīng)離心后再把紅細胞表面灰白色的白細胞層吸入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如為陳舊性出血的羊水標本，應(yīng)用液體培養(yǎng)基清洗沉淀細胞數(shù)次后接種，大量新鮮出血或穿刺性出血的羊水標本，應(yīng)去除部分離心沉淀的細胞中的下層紅細胞后接種培養(yǎng)。

2 細胞培養(yǎng)過程的室內(nèi)質(zhì)量控制

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)量控制

2.1.1 標準細胞生長試驗 每批培養(yǎng)基使用前及保存過程定期作標準細胞培養(yǎng)試驗，并作培養(yǎng)物目的細胞（各類可制作出染色體的細胞）計數(shù)，以檢查培養(yǎng)基的質(zhì)量。方法是根據(jù)培養(yǎng)物細胞濃度，用培養(yǎng)基或生理鹽水稀釋后或直接滴加培養(yǎng)物細胞懸液到白細胞計數(shù)池中計數(shù)，或按全自動血細胞計數(shù)儀計數(shù)。以目的細胞計數(shù)值為縱坐標，以培養(yǎng)基批號或質(zhì)控時間為橫坐標，連接各點，繪制直觀的室內(nèi)質(zhì)控圖，對比質(zhì)控圖上歷次相同條件下目的細胞計數(shù)值的偏離情況，發(fā)現(xiàn)目的細胞計數(shù)值偏低者（可繪制成Levey-Jennings、Westgard等臨床檢驗常用的質(zhì)控圖并按其常規(guī)處理方法處理），說明培養(yǎng)基質(zhì)量不符合要求，需及時做出處理。

2.1.2 無菌試驗 ①新批次培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶、注射器等無菌器材要做無菌試驗，或在使用過程中定期做無菌培養(yǎng)試驗，方法是用羊水細胞的處理、接種和培養(yǎng)：用注射器吸取培養(yǎng)基放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基有無變混濁，并做細菌培養(yǎng)鑒定，如有細菌生長，應(yīng)棄用污染的器材；②無菌室及培養(yǎng)箱內(nèi)定期作空氣及物表細菌培養(yǎng)試驗，記錄菌落數(shù)，并作細菌鑒定和藥敏試驗，掌握本室在不同季節(jié)、不同條件下可能發(fā)生的常見污染菌及其敏感的抗生素，制定污染預防措施。

2.2 細胞培養(yǎng)條件的室內(nèi)質(zhì)控 若溫度、濕度及CO2濃度不適宜、培養(yǎng)基營養(yǎng)不良，則會使細胞生長不良、染色體分裂象少、小、短、著色不良。應(yīng)作恒定或定期監(jiān)測、記錄。

2.2.1 培養(yǎng)箱溫度 細胞生長以（37±0.5）℃為佳，除了每天觀察培養(yǎng)箱指示溫度外，還應(yīng)在培養(yǎng)箱內(nèi)放置溫度計或控溫儀定時觀察與記錄結(jié)果，以確保培養(yǎng)箱的指示溫度與培養(yǎng)箱內(nèi)的實際溫度一致，從而確保細胞在實際的溫度下良好生長。

2.2.2 PHA質(zhì)量 PHA失效或含量不足會影響淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，從而影響淋巴細胞生長；反之若PHA過量，則細胞凝聚，同樣影響淋巴細胞生長，使染色體分裂象減少。

2.2.3 培養(yǎng)液的酸堿度 在培養(yǎng)箱內(nèi)通入5%CO2以維持不密封培養(yǎng)液的p H值穩(wěn)定，CO2濃度過高會使p H值太低，反之則p H值升高，兩者均會影響細胞生長，如果不在培養(yǎng)箱內(nèi)通入CO2，則必須蓋緊瓶蓋，使培養(yǎng)液處于密封狀態(tài)，以防CO2逸出而致p H值改變，如果此時培養(yǎng)液酸化較嚴重（培養(yǎng)液呈黃色），將不利于細胞生長，可加入2～3 ml新鮮培養(yǎng)液來校正。所用的培養(yǎng)瓶以具有可透過二氧化碳、水蒸汽等細胞生長所必需的小分子、但不易透過分子較大的細胞的瓶蓋較好，以使細胞在相對防污染的條件下培養(yǎng)。

3 染色體制片的室內(nèi)質(zhì)控

3.1 秋水仙素質(zhì)量與用量的影響 其作用是使細胞在增殖、分裂過程中停留在適合于染色體分析的中期，其質(zhì)量低劣、配制的濃度不足、作用的時間不夠就會使染色體分裂象細長、形態(tài)不佳、分裂象減少；其濃度過高或作用時間過長，雖會增多分裂象，但染色體過于濃縮短小，難辨帶紋，難以分析。在絨毛組織培養(yǎng)染色體制度備中，應(yīng)據(jù)收獲時生長細胞的數(shù)量加大秋水仙素用量。

3.2 低滲液質(zhì)量與作用程度的影響 低滲時間長、溫度高、低滲液濃度偏低會使染色體過度分散丟失，分裂象減少或不完整；反之染色體分散不佳，呈團塊狀或留有細胞漿背景，如因低滲不足致染色體分散不良，可加大冰醋酸在固定液內(nèi)的比例，再固定一次，以改善染色體分散程度。

3.3 離心速度與時間的影響 離心速度過低，細胞或染色體難以沉淀而丟失；離心速度過高、時間過長，可使胞膜過早破裂致染色體過度分散丟失，或使染色體成堆粘連無法分析，使分散良好的分裂象減少。

3.4 固定液質(zhì)量及用量的室內(nèi)質(zhì)控 固定液不新鮮、質(zhì)量不合格、配制不準確，則染色體模糊，、帶紋不請，染色體周圍有細胞漿背景；若增加更換固定液次數(shù)和延長固定時間（冰箱過夜次日固定）效果較好。預固定時加入固定液過多，或低滲不充分會造成殘留的核質(zhì)過多，影響染色體的展開和染色體顯帶的質(zhì)量。若固定時，加入固定液的速度太快、混勻太快則會使固定作用過強，染色體扭轉(zhuǎn)；固定液作用不足會使染色體出現(xiàn)毛刷狀，因此固定液純度要高，臨用時新配，應(yīng)沿管壁慢慢加入固定液后徹底打勻。

3.5 其他操作與條件的室內(nèi)質(zhì)控 吹打無力則細胞成團，用力過猛則細胞膜早破，染色體分散丟失，但剛加低滲液后要以能混勻沉淀細胞凝塊為標準，可以用力吹打，在低滲開始后，吹打必須很輕慢，尤其是羊水細胞，經(jīng)低滲后，在預固定、固定等步驟中，最好以吹氣泡或手指輕擊離心管底部的方法，使羊水細胞團塊均勻散開，這可使分裂象中染色體不丟失，亦可使分裂象不黏附在管壁上。在羊水細胞染色體制備過程中，若室溫超過30℃時會使染色體丟失，若室溫控制在25℃以下，可獲得良好的效果。滴片時滴加沉淀細胞懸液的量一般為2～3滴（根據(jù)沉淀細胞的量決定），否則細胞核染色體分裂象會流失減少。滴片后應(yīng)立即使全片在酒精燈外焰通過10個來回，每個來回約1秒鐘，然后置37℃2～3天后或75～80℃3小時后，每次以固定時間顯帶。標本保存時間（片齡）越長對胰酶消化抵抗力越強，片齡超過20天者甚至不顯帶紋。

3.6 試劑與器材的室內(nèi)質(zhì)控 各種試劑嚴格按操作過程配制，尤其是胰酶要在有效期內(nèi)使用，用前校正值p H7.2，此為胰酶作用的最適p H，活性最強，并嚴防酸堿、細菌及重金屬離子等污染，以免胰酶失活。胰酶可用Hanks液、0.02%EDTA、生理鹽水或蒸餾水配制成所需濃度后使用，Hanks液為緩沖液，有穩(wěn)定p H作用，生理鹽水中的Na＋有激活胰酶活性的作用，為了防止重金屬離子污染使胰酶失活，可選用0.02%EDTA溶液配制，EDTA是一種化學螯合劑，能與重金屬離子結(jié)合而形成螯合物，從而保持胰酶穩(wěn)定，所以在Hanks液中加入EDTA使終濃度為0.02%，加入NaCl使Na＋終濃度為0.9%后配制胰酶消化液，顯帶效果較好，用濃度低的胰酶和延長顯帶處理時間，對較細的亞帶顯帶效果較好。所用載玻片要清潔，有酸堿、油脂、冷卻不夠活未達玻片表面浮霜均會影響細胞鋪開，從而使細胞及染色體分裂象流失、分散不均勻、或有油泡等。

3.7 染色體顯帶及染色過程的室內(nèi)質(zhì)控 甘油要用分析純，甲醇要用無水分析純（AR純）或優(yōu)級純（GR純），染料粉末要在甘油中充分研磨后加熱完全溶解，染色體原液要密封避光防氧化保存3個月以上使用，且保存時間越長越好，緩沖液p H值及離子強度要準確，否則會影響染色，胰酶顯帶后，在加染色液前須沖洗干凈，否則殘留的胰酶會在染色過程中起作用，使染色體消化過度而呈現(xiàn)相應(yīng)的形態(tài)，或呈現(xiàn)帶紋不清、腫脹及小空泡狀，影響染色效果。此外，固定、低滲、培養(yǎng)條件及細胞生長周期等均會影響染色效果。

4 羊水細胞培養(yǎng)染色體制備結(jié)果的質(zhì)量評估

4.1 細胞培養(yǎng)質(zhì)量評估 通常情況下，羊水細胞按常規(guī)培養(yǎng)7天，換液后再培養(yǎng)1天左右，然后在低倍鏡下觀察結(jié)果，按以下標準判斷培養(yǎng)質(zhì)量。對于達不到下列要求者，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)，否則會致染色體制片失敗。

優(yōu)：在兩培養(yǎng)瓶中貼壁生長細胞的面積至少達50個滿低倍視野，細胞生長密度達85%～95%，其中小圓形細胞占50%以上。

良：在兩培養(yǎng)瓶中貼壁生長細胞的面積至少達30個滿低倍視野，細胞生長密度達85%～95%，其中小圓形細胞占30%以上。

合格：在兩培養(yǎng)瓶中貼壁生長細胞的面積至少達10個滿低倍視野，細胞生長密度達85%～95%，其中小圓形細胞占10%以上。

不合格：在兩培養(yǎng)瓶中貼壁生長細胞的面積不到10個滿低倍視野，細胞生長密度稀疏，幾乎無小圓形細胞。

4.2 染色體制片質(zhì)量評估 按常規(guī)方法制片，每個培養(yǎng)瓶中的細胞可先制2張片（余下細胞保留備用），然后按以下標準判斷制片質(zhì)量（包括從培養(yǎng)、細胞收集、低滲、固定、烤片等的各個環(huán)節(jié)），其中以下所指的可分析分裂象是指一個分裂象中染色體數(shù)目為46條，染色體基本無重疊、無交叉，分散均勻，染紫紅色，長短適中，能看清顯帶染色體的結(jié)構(gòu)異常；可計數(shù)分裂象是指能計數(shù)染色體數(shù)目。

優(yōu)：顯帶后每片中可見30個以上可分析分裂象，有較多的可計數(shù)分裂象。

良：顯帶后每片中可見15個以上可分析分裂象，有較多的可計數(shù)分裂象。

合格：顯帶后每片中可見3～5個以上可分析分裂象，可計數(shù)分裂象達10個以上。

不合格：看完全部經(jīng)顯帶的原代和傳代羊水細胞片，其中可分析分裂象不到5個，可計數(shù)分裂象不到30個，無法作出報告。

4.3 染色體顯帶質(zhì)量評估 優(yōu)：在可分析分裂象中，可清晰辨認出50%以上的16q 2條帶紋，可清晰辨認出幾乎所有的10q 3條帶紋，其他染色體顯帶清晰。

合格：在可分析分裂象中，可清晰辨認出70%以上的10q 3條帶紋，可辨認出部分16q的2條帶紋及其他染色體的主要帶紋。

不合格：看完所有片子，找不到5個分帶清晰的分裂象，無法作出報告。

5 外周血染色體分析室內(nèi)質(zhì)量評估

5.1 細胞培養(yǎng)考評標準 細胞培養(yǎng)的質(zhì)量是制片質(zhì)量的基礎(chǔ)，可用淋巴細胞轉(zhuǎn)化檢查來考評細胞培養(yǎng)質(zhì)量。具體方法是取1滴細胞培養(yǎng)液與載玻片上，制成推片，干燥后用吉姆薩染色，油鏡下見比小淋巴細胞大3倍以上，并可呈染色體分散狀的分裂象的大淋巴細胞即為淋巴母細胞，根據(jù)油鏡下見到的所有淋巴母細胞占白細胞的百分比數(shù)來計算淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率。

優(yōu)良或合格：在涂片均勻、基本無細胞重疊的細胞片中，平均每個油鏡視野中淋巴母細胞達3～5個，轉(zhuǎn)化率達30%，或根據(jù)細胞培養(yǎng)液體積、細胞計數(shù)及轉(zhuǎn)化率算出淋巴母細胞絕對值，用其絕對值來考評。

不合格：大淋巴母細胞較少、較小，多數(shù)為小型淋巴細胞，并且分裂象很少或未見到分裂象，所見到的分裂細胞小，其中染色體密集不散開，或淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率小于30%。

5.2 制片與顯帶 優(yōu)良：幾乎每個低倍視野均可找到1個以上可分析分裂象，染色良好，分帶清晰，10q的3條帶紋清晰易分辨，能辨認出每條染色體的細微結(jié)構(gòu)，能分別辨認出16p及16q的1條及2條帶紋。

合格：在所有血片中，至少能找到20個可分析分裂象，10q的3條帶紋清晰易辨，能辨認出每條染色體的細微結(jié)構(gòu)。

不合格：達不到合格標準，無法完成報告。

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