牛STAT1基因啟動子區(qū)多態(tài)性研究

焦仁剛，楊永強，龔 俞，惠嫣婷，劉若余＊

（1.貴州省畜牧技術(shù)推廣站，貴州貴陽550001；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院／高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室／貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽550025）

Janus激酶或信號轉(zhuǎn)錄因子及活化子（Janus kinase／signal transducer 和activator of transcription）（JAK－STAT）是最重要的細(xì)胞因子和生長因子信號通路之一［1］。生長激素（Growth hormone，GH）通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞生長和分化。GH 信號通路由細(xì)胞表面的生長激素受體（Growth hormone receptor，GHR）二聚體化引發(fā)，進(jìn)入JAK－STAT 信號通路引發(fā)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，GHR 活化后進(jìn)而磷酸化下游的STAT 蛋白，STAT 蛋白以二聚體形式進(jìn)入核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)［2］。STAT 蛋白是胞質(zhì)中潛在的轉(zhuǎn)錄因子，含有SH2結(jié)構(gòu)域，酪氨酸磷酸化位點和DNA 結(jié)合和反式激活域［3］。GH 信號通路主要由STAT1、STAT3、STAT5A 和STAT5B 參與調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)［4］。STAT1 與STAT3形成異源二聚體或單獨形成同源二聚體結(jié)合到c－fos等基因啟動子進(jìn)而調(diào)節(jié)其表達(dá)水平［5］。

Cobanoglu等［6］利用DNA 池在牛STAT1 基因鑒定到1個SNP位點，其中等位基因C顯著提高奶牛乳脂率和乳蛋白率。基因啟動子變異通過改變RNA 聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合影響基因表達(dá)水平。目前對于牛STAT1基因啟動子多態(tài)性研究極少，本試驗為篩選STAT1 基因啟動子區(qū)SNP及研究其對啟動子功能元件的影響，選擇貴州地方優(yōu)良品種務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛兩種品種差異明顯的品種構(gòu)建DNA 池，直接測序后DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接和校正，BLAST 分析STAT1基因多態(tài)性，并與NCBI中SNP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，首次在牛STAT1 基因啟動子區(qū)篩查到SNP位點。生物信息學(xué)軟件預(yù)測序列核心啟動子區(qū)和CpG 島，并分析SNP 位點對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和RNA 二級結(jié)構(gòu)等影響。

1 材料與方法

1.1 DNA 提取與DNA 池構(gòu)建

54個貴州荷斯坦奶牛血樣采自貴州貴陽三聯(lián)乳業(yè)公司第二奶牛場，務(wù)川黑牛血樣45個采自貴州務(wù)川仡佬苗族自治縣仡佬牧業(yè)公司種牛場。血液基因組提取試劑盒（生工生物工程有限公司）提取牛DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取效果，每個DNA 樣品濃度使用紫外分光光度計測量3 次，取平均值。務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛DNA 樣品分別調(diào)整相同濃度至100ng／μL，各取5μL 混合構(gòu)建成2個DNA 池。

1.2 引物設(shè)計和DNA 擴增

以牛STAT1（GenBank 登錄號：AC＿000159.1）DNA 序列，利用Primer－BLAST 設(shè)計1對特異性引物，上游引物為：5＇－CTGAGCTTCAAAGCCTCCAGA－3＇；下游引物為：5＇－GGTCCAACAAGTTTTGAGTCCTG－3＇。PCR 擴增得到STAT1 基因5＇調(diào)控區(qū)及第1外顯子總長1 122bp。構(gòu)建DNA 池進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)體系為25μL：2×Taq PCR Master Mix試劑12.5μL，上、下游引物（濃度為10 pmol／μL）各1.5μL，基因組DNA 2.5μL，三蒸水7 μL。采用Bio－Rad公司PCR 擴增儀進(jìn)行DNA 擴增，PCR 擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性40s，61.5 ℃退火45s，72 ℃延伸50s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.3 序列分析

把特異性好的PCR產(chǎn)物委托諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測序，特異性不好的PCR 產(chǎn)物利用DNA 純化回收試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行純化后測序，3次獨立測序。用DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行校正，BLAST分析確定SNPs。

1.4 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)軟件根據(jù)數(shù)學(xué)模型或不同算法預(yù)測結(jié)果，不同軟件可能因計算方法和閾值設(shè)定的差異得到不同預(yù)測結(jié)果，利用多種軟件比較分析可最大限度提高預(yù)測準(zhǔn)確性，充分發(fā)揮其參考價值。將突變前后序列遞交在線軟件，得到預(yù)測后進(jìn)行分析。

（1）啟動子預(yù)測：Promoter SCAN ：http：／／www－bimas.cit.nih.gov／molbio／proscan／；Neural Network Promoter Prediction：http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html；Promoter 2.0：http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Promoter／；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／

（2）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測：Tfsitescan：http：／／www.ifti.org／；TESS ：http：／／www.cbil.upenn.edu／cgi－bin／tess／tess；TFSEARCH：http：／／www.cbrc.jp／research／db／TFSEARCH.html；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／cgibin／programs／promoter／nsite.pl；GeneBuilder ：http：／／zeus2.itb.cnr.it／～webgene／genebuilder.html

（3）RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：Genebee：http：／／www.genebee.msu.su／services／rna2＿reduced.html；EVOLGA：http：／／wwwmgs.bionet.nsc.ru／mgs／programs／2dstructrna／evolga.html.

（4）CpG 島預(yù)測：Bio－soft：http：／／www.biosoft.net／sms／cpg＿island.html；MethPrimer：http：／／www.urogene.org／methprimer／index1.html；Webgene：http：／／zeus2.itb.cnr.it／cgi－bin／wwwcpg.pl；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic ＝cpgfinder＆group ＝programs＆subgroup ＝promoter； CpG Island Searcher ：http：／／www.uscnorris.com／cpgislands2／cpg.aspx.

圖1 務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛STAT1基因DNA 池檢測M.DL 2 000 Marker；1.務(wù)川黑牛DNA 池PCR 產(chǎn)物；2.貴州荷斯坦奶牛DNA 池PCR 產(chǎn)物Fig.1 Results of DNA pooling of STAT1in two breedsM.DL 2 000 Marker；1.DNA pooling of Wuchuan black cattle；2.DNA pooling of Guizhou Holstein cow

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 池的PCR 產(chǎn)物測序

設(shè)計特異性引物分別擴增出務(wù)川黑牛和荷斯坦奶牛STAT1基因目的序列共1 122bp，見圖1。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行3 次獨立雙向測序，BLAST 分析共發(fā)現(xiàn)3個SNPs，以STAT1基因第1外顯子第1 位為＋1 位，SNPs 位點分別為：T－537G、T－508A、C＋10T（圖2）。對于2個生長性能差異明顯的牛種，務(wù)川黑牛生長性能優(yōu)于荷斯坦奶牛，而荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性能較務(wù)川黑牛更好。T－537G 多態(tài)性位點在兩個牛種中均存在，該突變位點是否造成其生長性能差異需進(jìn)一步研究。貴州荷斯坦奶牛T－508A、C＋10T 兩個位點均出現(xiàn)雜合子，而務(wù)川黑牛在該位點并不表現(xiàn)多態(tài)性，該位點可能對兩個品種產(chǎn)奶性能有一定影響。

2.2 STAT1基因啟動子預(yù)測

利用4種不同軟件對測序得到的STAT1基因調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行啟動子預(yù)測，僅有Neural Network Promoter Prediction軟件發(fā)現(xiàn)2個可能的核心啟動子區(qū)域，第－14～＋36bp評分為0.71，＋245～＋295范圍評分達(dá)到0.92（表1）。說明STAT1基因5＇調(diào)控區(qū)具有的軟件可識別啟動子特征不明顯。本研究所發(fā)現(xiàn)C＋10T 位點處于核心啟動子區(qū)域，并且靠近轉(zhuǎn)錄起始位點，可能在調(diào)控STAT1 基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，而另兩個SNP位點可能作用于其他調(diào)控區(qū)域而影響基因表達(dá)水平。

圖2 STAT1基因DNA 池的PCR 產(chǎn)物測序和BLAST 分析Fig.2 Sequencing and BLASTof STAT1PCR products

表1 啟動子預(yù)測結(jié)果Table 1 Results of promoter prediction

2.3 STAT1基因5＇調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

采用Tfsitescan、TESS、TFSEARCH 等5種生物學(xué)軟件對STAT1基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測和綜合分析（表2）。結(jié)果表明：遞交序列包含TFⅡD、Pit－1、IRF－1、IRE、γ－IRE、γ－globin、FOX protein、AP－2、C／EBP、SP1 等對STAT1 基因表達(dá)起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并有TATA box、GC box、CCAC box等啟動子重要元件結(jié)合位點。將突變后的序列重新提交，比較發(fā)現(xiàn)突變造成從－510位開始，新產(chǎn)生GATA－1＿CS2、NF－E1.2、NF－E1＿CS1、NF－E1＿CS2、GATA－1－EpoR、GATA－1－MC－CPA、GATA－1＿CS1、GATA－6＿CS、GATA＿consensus、NF－E110個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。造成－508位原有的轉(zhuǎn)錄因子BPC1＿CS結(jié)合位點消失（圖3）。本研究發(fā)現(xiàn)T－508A 突變附近位置發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的顯著改變，幾乎所有軟件均預(yù)測該SNP位點會導(dǎo)致新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點產(chǎn)生，該位點雖不處于預(yù)測的核心啟動子區(qū)，但可能通過影響增強子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。

表2 STAT1基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction of transcription factors binding sites of STAT1gene

2.4 STAT1基因RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

突變前后STAT1基因的RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖4）結(jié)果表明：多態(tài)性位點未引起RNA 二級結(jié)構(gòu)最小自由能改變，突變前后均為－9.694×105J／mol。但SNP 位點顯著改變RNA 二級結(jié)構(gòu)，從＋78位～＋408范圍莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，并在突變后導(dǎo)致＋78位點附近原本較穩(wěn)定的莖區(qū)變?yōu)闊o堿基互補配對的環(huán)區(qū)，顯著影響RNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可能影響隨后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及后續(xù)轉(zhuǎn)錄翻譯過程。有趣的是，本研究篩選到的SNP位點均遠(yuǎn)離RNA 二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變的范圍，說明RNA 二級結(jié)構(gòu)可受遠(yuǎn)端單堿基突變影響。

圖3 TFSEARCH 軟件轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction of transcription factors binding sites by TFSEARCH

圖4 STAT1基因RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.4 RNA secondary structure prediction of STAT1gene

2.5 STAT1基因5＇調(diào)控區(qū)CpG 島預(yù)測

啟動子區(qū)CpG 島通常處于非甲基化狀態(tài)，可與特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但異常甲基化的CpG 島顯著降低與反式作用因子的結(jié)合活性，DNA 甲基化可直接干擾特異性轉(zhuǎn)錄因子EZF、CREB、APZ等與啟動子序列結(jié)合抑制基因表達(dá)［7］。本研究利用Webgene和MethPrimer等5種生物信息學(xué)軟件預(yù)測目標(biāo)序列CpG 島（表3，圖5），以GC 含量大于50%，Obs／Exp比值＞0.6和CpG 島范圍大于200bp為判定標(biāo)準(zhǔn)，以轉(zhuǎn)錄起始位點為0位，上下游分別以正、負(fù)號標(biāo)明，各軟件在目的序列中均預(yù)測有CpG島存在，說明STAT1啟動子序列中CpG 島可能對其功能發(fā)揮具有重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)的SNP位點均處于各軟件預(yù)測的CpG 島區(qū)，但未對CpG 島范圍造成明顯影響，說明本研究所發(fā)現(xiàn)SNP 對STAT1基因啟動子區(qū)甲基化水平影響較小。

表3 不同軟件預(yù)測STAT1基因啟動子區(qū)CpG 島Table 3 Prediction of CpG island of STAT1gene by various software

圖5 MethPrimer軟件預(yù)測CpG 島結(jié)果Fig.5 Prediction of CpG island by MethPrimer software

3 討論

STAT 蛋白家族共有7 個成員，分別為STAT1－4、STAT5A、STAT5B、STAT6［8］。在GH信號通路中，GH 首先誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體GHR 二聚體化，進(jìn)而導(dǎo)致JAK2激酶磷酸化而激活。激活的JAK2使自身及GHR 的酪氨酸殘基磷酸化，活化的JAK2和GHR 構(gòu)成復(fù)合物吸引STAT 蛋白等下游蛋白與其高親和力位點結(jié)合，激活的STAT 蛋白形成同源或異源二聚體進(jìn)入核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)［9］。STAT1 激活后可與STAT3 蛋白構(gòu)成異源二聚體復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)，Khatib 等［10］通過牛體外受精試驗證實STAT1、STAT3基因SNP 位點與牛受精率（fertilization rate）和胚胎存活率（embryonic survival rates）顯著相關(guān)，STAT1和STAT3優(yōu)勢基因型的交互作用更能提高受精率和胚胎存活率。STAT1蛋白涉及牛乳腺發(fā)育，可能與牛產(chǎn)奶性能有關(guān)系。

對于牛STAT1基因多態(tài)性研究較少，Cobanoglu等將其作為產(chǎn)奶性能候選基因進(jìn)行多態(tài)性分析后，褚敏等［11］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)STAT1基因內(nèi)含子11存在SNP位點，其BB 為中國荷斯坦奶牛第一、二胎次乳蛋白率的優(yōu)勢基因型，而3＇－UTR 中C 等位基因可促進(jìn)第一、二胎次產(chǎn)奶量和乳蛋白率。本試驗首次針對STAT1 啟動子區(qū)鑒定SNP 位點，在STAT1基因5＇調(diào)控區(qū)及第1外顯子鑒定得到3個SNP位點，對于2 個生長性能差異明顯的牛種，務(wù)川黑牛作為貴州地方優(yōu)良品種，因其良好的生長、肉質(zhì)性能深受養(yǎng)殖戶看重，其生長性能優(yōu)于荷斯坦奶牛。T－537G 多態(tài)性位點在兩個牛種中均存在，該突變位點是否造成其生長性能差異需進(jìn)一步研究。荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性能相較務(wù)川黑牛更好，貴州荷斯坦奶牛T－508A、C＋10T 兩個位點均出現(xiàn)雜合子，而務(wù)川黑牛在該位點并不表現(xiàn)多態(tài)性，該位點可能對兩個品種產(chǎn)奶性能有一定影響，下一步將針對該SNP位點進(jìn)行功能性驗證。

不同軟件預(yù)測核心啟動子和CpG 島區(qū)域有差異，利用多種軟件綜合分析可最大限度提高預(yù)測準(zhǔn)確性，本研究所發(fā)現(xiàn)C＋10T 位點處于核心啟動子區(qū)域，并且靠近轉(zhuǎn)錄起始位點，可能在調(diào)控STAT1基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，而另兩個SNP位點可能作用于其他調(diào)控區(qū)域而影響基因表達(dá)水平。SNP位點突變均導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點消失和產(chǎn)生新結(jié)合位點，其中T－537G、T－508A 對其附近的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點影響較大，說明突變位點可直接影響特異轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的結(jié)合，該位點還對STAT1基因二級結(jié)構(gòu)有影響，造成從＋78位～＋408范圍莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變，SNP 位點導(dǎo)致＋78位點附近原本穩(wěn)定的莖區(qū)變?yōu)闊o堿基互補配對的環(huán)區(qū)，顯著影響RNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而遠(yuǎn)端C＋10T 對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點無顯著影響。DNA 甲基化可顯著降低靶基因表達(dá)水平，5種生物信息學(xué)軟件均預(yù)測STAT1基因啟動子區(qū)域具有范圍較大的CpG 島，說明DNA 甲基化水平對STAT1基因表達(dá)調(diào)控有重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)的SNP位點均處于各軟件預(yù)測的CpG 島區(qū)，但未對CpG 島范圍和GC 含量造成明顯影響，說明多態(tài)性位點通過改變STAT1 基因啟動子甲基化水平而調(diào)控基因表達(dá)的可能性較小。對STAT1基因SNP 研究結(jié)果為進(jìn)一步分析STAT1啟動子功能奠定實驗基礎(chǔ)。

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