胰腺高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及其miRNA的研究進(jìn)展

塔娜 鄭建明

胰腺高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及其miRNA的研究進(jìn)展

塔娜 鄭建明

胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)是指胰腺中小導(dǎo)管上皮細(xì)胞從不典型增生至原位癌這一系列病變的連續(xù)過程，根據(jù)其組織學(xué)異型性可分為3期，其中PanIN-1、2期為低級(jí)別，PanIN-3期為高級(jí)別[1-3]。目前已經(jīng)證實(shí)PanIN-3期是胰腺癌最直接的癌前病變[4]。如果能在該期作出診斷，及時(shí)進(jìn)行干預(yù)和治療，是完全可以治愈胰腺癌的。因此尋找此期的特異性標(biāo)志物是解決問題的關(guān)鍵。近年研究表明，miRNA不僅在腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性[5]，而且在外周血中的表達(dá)同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，與RNA比較，其表達(dá)穩(wěn)定性更為顯著，因此認(rèn)為外周血miRNA可能是一種理想的腫瘤分子標(biāo)志物。同樣，胰液中miRNAs檢測(cè)也是早期診斷胰腺疾病的重要途徑[6]。因此，篩查和鑒定PanIN-3期組織和血或胰液中特異表達(dá)的miRNAs，探討其作為胰腺癌早期診斷分子標(biāo)志物的潛在可能性，對(duì)于提高胰腺癌的早期診斷率，改善其預(yù)后具有非常重要的意義。

一、胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)

1．PanIN的病理特征和命名：PanIN是一種顯微鏡下才能觀察到的胰腺中小導(dǎo)管上皮細(xì)胞出現(xiàn)的扁平或乳頭狀增生性病變，有一定程度異型性，屬于非侵襲性病變。人類早在一個(gè)多世紀(jì)之前就已觀察到此類病變，但由于缺乏統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)和命名，使用的術(shù)語(yǔ)各不相同。為了探討胰腺導(dǎo)管病變新分級(jí)系統(tǒng)的科學(xué)性，1999年世界胰腺癌研究組將35例具有代表性的胰腺導(dǎo)管病變HE切片分別送給8位來(lái)自美國(guó)、加拿大和歐洲的病理學(xué)家，結(jié)果幾乎每一例病理診斷都存在較大差異。為尋求統(tǒng)一，在后來(lái)的研討會(huì)上病理學(xué)家們同意采用Klimstra和Longnecker等提出的“胰腺上皮內(nèi)腫瘤”這一新概念和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]。對(duì)照此標(biāo)準(zhǔn)，8位病理學(xué)家再一次復(fù)習(xí)原來(lái)的35例切片，并重新進(jìn)行診斷，結(jié)果只有7例出現(xiàn)分歧，這一結(jié)果充分顯示出新分級(jí)系統(tǒng)的科學(xué)性和實(shí)用性。在2003年召開的胰腺癌前病變會(huì)議就PanIN的組織學(xué)診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成了國(guó)際共識(shí)[8]。

2．PanIN的臨床特征：PanIN是只有在顯微鏡下才能觀察到的病變，因此臨床上是無(wú)癥狀的。PanIN可發(fā)生于各種胰腺病變中，甚至在正常胰腺組織中亦可出現(xiàn)，特別是低級(jí)別PanIN。但在慢性胰腺炎、胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀腫瘤、黏液性囊腺瘤和胰腺導(dǎo)管腺癌等病變中出現(xiàn)的頻率較正常胰腺組織和其他胰腺良性病變中要高，特別是胰腺導(dǎo)管腺癌中，出現(xiàn)高級(jí)別PanIN的可能性要明顯高于胰腺良性病變[9]。Andea等[10]研究顯示，在慢性胰腺炎特別是胰腺癌癌周組織中經(jīng)?？梢砸姷揭认偕掀?nèi)腫瘤性病變，隨訪結(jié)果也顯示PanIN，特別是高級(jí)別PanIN與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。筆者對(duì)250例不同胰腺組織中PanIN的發(fā)生率和分級(jí)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示PanIN的發(fā)生率為62.4%，從正常胰腺到慢性胰腺炎到胰腺導(dǎo)管腺癌組織中PanIN的發(fā)生率逐漸增加，尤其是高級(jí)別PanIN更為顯著，PanIN-3期僅見于導(dǎo)管腺癌中[11]。

3．PanIN的分子遺傳學(xué)改變：研究顯示，隨著PanIN級(jí)別的升高，構(gòu)成其細(xì)胞的突變率隨之增高，二者呈平行關(guān)系，高級(jí)別PanIN遺傳學(xué)改變也在浸潤(rùn)癌中出現(xiàn)。Swaitz等[12]對(duì)PanIN和浸潤(rùn)癌進(jìn)行黏蛋白4表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)癌恒定表達(dá)黏蛋白4，而PanIN隨著級(jí)別增加，黏蛋白4表達(dá)也隨之增強(qiáng)。還有人對(duì)胰腺癌和PanIN的p53和DPC4基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高級(jí)別PanIN和胰腺癌一樣存在等位基因缺失。Feldmann等[13]通過檢測(cè)正常胰腺導(dǎo)管和各級(jí)別PanIN性病變的基因改變，將胰腺癌的組織學(xué)進(jìn)展與分子遺傳學(xué)改變聯(lián)系了起來(lái)。該模型顯示從正常胰腺導(dǎo)管上皮發(fā)展到PanIN-3期伴有多種基因的改變和染色體的異常，早期有K-ras基因和Her-2/neu基因突變，中期有p16基因失活和染色體9p的雜合性缺失，而晚期則有p53、DPC4和BRCA2基因的異常和染色體6q、17p和18q的雜合性缺失。此外，目前PanIN中涉及的分子遺傳學(xué)改變還包括端粒酶、黏蛋白、BRCA2基因、炎性細(xì)胞因子、miRNA和表觀遺傳學(xué)的改變等[14]。筆者通過建立PanIN和胰腺癌的組織芯片，對(duì)比研究了細(xì)胞增殖周期中多種相關(guān)基因改變和蛋白的表達(dá)，結(jié)果也顯示出正常導(dǎo)管-低級(jí)別PanIN-高級(jí)別PanIN的演變過程[15]。

4．PanIN的動(dòng)物模型：為了更好地研究PanIN發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，探索胰腺癌早期診斷和有效治療方法，最早的研究者采用化學(xué)誘導(dǎo)方法建立胰腺癌動(dòng)物模型，如用亞硝胺類化合物或用偶氮絲氨酸誘導(dǎo)方法。此類模型的特點(diǎn)是制備方法簡(jiǎn)單、方便，但周期長(zhǎng)，誘導(dǎo)成功率低，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤其病理形態(tài)學(xué)特征與人類腫瘤差別很大。后來(lái)人們通過接種在動(dòng)物體內(nèi)建立了人胰腺癌皮下或原位移植瘤模型，但這些模型只能用于特定的研究目的，如藥物篩選或轉(zhuǎn)移機(jī)制研究等。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立為獲取胰腺癌早期病變樣本提供了一條新途徑[16]。Hingorani等[17]通過轉(zhuǎn)基因小鼠成功進(jìn)行了胰腺癌早期病變的造模，為早期胰腺癌標(biāo)志物研究所需樣本提供了來(lái)源。在該模型中，腫瘤穩(wěn)定發(fā)生，研究者可以根據(jù)研究需要，獲取不同階段的腫瘤樣本，已成為最經(jīng)典的胰腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型。Ijichi等[18]建立的腫瘤模型的病理特征非常接近于人類胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)。該模型PanIN的發(fā)生率更高，耗時(shí)更短，為開展PanIN-3期和早期胰腺癌分子標(biāo)志物篩選創(chuàng)造了條件。Thayer等[19]建立的Pdx1-Cre-CLEG2-K-rasG12D模型更加接近于人類胰腺癌。此類采用“轉(zhuǎn)基因可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)”以K-ras轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ)誘導(dǎo)的多基因聯(lián)合作用的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可成功誘導(dǎo)PanIN的發(fā)生，復(fù)制出人類胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為胰腺癌的發(fā)病機(jī)制研究開辟了新途徑。

二、胰腺上皮內(nèi)瘤變中miRNA

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度19～24個(gè)核苷酸，通過與mRNA特定區(qū)域結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯進(jìn)行調(diào)控，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。目前已報(bào)道1000多種人類miRNA，其中一部分miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡和分化中發(fā)揮作用。多種腫瘤及癌前病變中存在miRNA表達(dá)譜的改變。

1．動(dòng)物模型PanIN中miRNA研究進(jìn)展：du Rieu等[20]研究了29例K-ras(G12D)突變小鼠胰腺腺管PanIN組織，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-205和miR-200在小鼠PanIN組織中表達(dá)增高，并用原位分子雜交技術(shù)證明在胰腺非典型增生的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中miR-21的表達(dá)增高。LaConti等[21]通過建立基因工程胰腺癌小鼠模型(p48-Cre/LSL-KrasG12D)獲取各級(jí)別PanINs進(jìn)行差異miRNAs篩選。結(jié)果顯示，與正常導(dǎo)管上皮相比，隨PanIN級(jí)別升高而表達(dá)升高的miRNAs有miR-10、miR-16、miR-21、miR-100、miR-155，它們?cè)诟呒?jí)別PanIN和癌組織中維持高表達(dá)，而降低的有miR-22、miR-148a/b、miR-212和miR-375。該研究還對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行了分析。Hanoun等[22]也在基因敲除小鼠LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre+/-PanIN-1B、PanIN-2和PanIN-3中發(fā)現(xiàn)miR-148a明顯下調(diào)，其原因是由于編碼miR-148a的DNA甲基化所致。

2．人體組織PanIN中miRNA研究進(jìn)展：Szafranska等[23]研究顯示，60%的PanIN-3期中表達(dá)miR-196a，而PanIN-1期中不表達(dá)，提示miR-196a與胰腺癌發(fā)展有關(guān)。du Rieu等[20]通過顯微切割方法獲取人和胰腺癌小鼠PanIN組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)7種成熟miRNAs在PanIN中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-21隨PanIN分級(jí)增加而上升，認(rèn)為miR-21可作為胰腺癌早期診斷的分子標(biāo)志物。但該研究沒有篩查PanIN-3期存在的特異性miRNAs。Ryu等[24]分析了miR-21、miR-155和miR-221在胰腺PanIN-1、PanIN-2和PanlN-3期中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-155在PanIN-2期表達(dá)上調(diào)，miR-21在PanlN-3期表達(dá)上調(diào)，提示miR-155表達(dá)異常出現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌的較早期階段，miR-155可作為胰腺癌前病變的生物學(xué)標(biāo)記物。Yu等[25]采用激光顯微切割方法獲取人胰腺組織中的各級(jí)別PanIN病變和正常導(dǎo)管上皮，通過miRNA芯片篩查，鑒別出各級(jí)別PanINs中有107種miRNA存在異常表達(dá)，PanIN-3期中有35種表達(dá)異常，其中表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)(超過5倍以上)的miRNAs分別有20余種和10余種，上調(diào)表達(dá)的miRNAs有miR-106b-5p、miR-31-5p、miR-142、miR-101-3p、miR-29、miR-17-5p、miR-200b-3p、miR-195-5p、let-7g-5p、miR-93-5p、miR-21、miR-513b、miR-155、miR-4778-3p、miR-376a-5p、miR-3175、miR-146-5p、let-7a-5p、miR-1290、miR-34a-3p、miR-548a、miR-126-3p等；下調(diào)表達(dá)的miRNAs有miR-15a-5p、miR-125-3p3、miR-29c-3p、miR-16-5p、miR-218-3p、miR-127-3p7、miR-3122、miR-548、miR-126-3p、miR-3175、miR-217、miR-26a-5p、miR-150、miR-154-5p等；miR-196b是PanIN-3中特有的，認(rèn)為它可以作為PanIN-3期診斷的分子標(biāo)志物。

三、展望

miRNA在組織中不易降解，能夠穩(wěn)定地存在，且能夠游離于細(xì)胞外，穩(wěn)定存在于血漿或血清，具備疾病分子生物學(xué)標(biāo)志物的特點(diǎn)，已在腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估中顯示了獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。但miRNA作為早期胰腺癌標(biāo)志物的研究仍存在諸多問題，如通常在小樣本研究中得到的PanIN相關(guān)miRNA表達(dá)譜能否作為生物學(xué)標(biāo)志物尚需在大樣本研究中得以驗(yàn)證；miRNA在胰腺癌發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明；miRNA異常表達(dá)在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)和癌變的時(shí)間尚需進(jìn)一步確定等。相信隨著研究的不斷深入和上述問題的闡明，將有助于加快miRNA作為早期胰腺癌，尤其是PanIN-3期生物學(xué)標(biāo)志物由實(shí)驗(yàn)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，為胰腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供新的分子靶標(biāo)。

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2013-08-20)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.024

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172077)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院病理科

鄭建明，Email: jmzheng1962@163.com