骨髓間充質(zhì)干細胞治療椎間盤退行性病變的研究進展

袁超群 綜述 張海龍 審校

椎間盤退行性病變具有高發(fā)病率和高致殘率[1]，由于髓核組織損壞、變性具有不可逆性，脊柱融合手術(shù)為治療的“金標準”，但手術(shù)難以恢復椎間盤的結(jié)構(gòu)與功能。組織工程是永久性修復椎間盤的新策略。BMSCs是當前研究的焦點。本文就BMSCs治療椎間盤退行性病變的研究進展進行綜述。

1 椎間盤的病理生理學

椎間盤位于相鄰椎體之間，由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板三部分構(gòu)成。髓核細胞為類軟骨樣細胞，纖維環(huán)細胞形態(tài)細長，似成纖維細胞[2]。髓核細胞基質(zhì)富含蛋白聚糖、Ⅱ型膠原，而纖維環(huán)細胞基質(zhì)含豐富的Ⅰ型膠原、少量的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原。從髓核中央向外，Ⅱ型膠原逐漸減少，而Ⅰ型膠原逐漸增多。

椎間盤退行性病變的病因尚不明確，可能跟負載過大、生物力學改變、基因、營養(yǎng)障礙、細胞變異等有關(guān)。椎間盤退行性病變最初發(fā)生于細胞水平，這為細胞治療及椎間盤再生提供了一定的證據(jù)。實驗證明，細胞凋亡[3]和細胞衰老[4]是導致椎間盤功能細胞數(shù)量減少，以及力學結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要原因。體外研究證明，退變的椎間盤中，白介素-1（IL-1）含量顯著增高，而白介素-1拮抗劑（IL-1Ra）含量并無改變，IL-1可以產(chǎn)生大量的蛋白水解酶，包括：基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和ADAMTS（由解聚素、基質(zhì)金屬蛋白酶和血栓粘合素組成），可以進一步破壞椎間盤組織[5]。Blumenthal等[6]發(fā)現(xiàn)，在椎間盤中過度表達IL-1Ra可抑制蛋白水解酶活性，減緩椎間盤退行性病變，證實了IL-1Ra治療椎間盤退行性病變的可能。

2 傳統(tǒng)治療椎間盤退變的策略

大多數(shù)患者可通過休息或保守治療緩解癥狀[7]。常見的保守治療包括：藥物治療、物理治療、運動治療、針灸、按摩等。另外，可選擇局部注射皮質(zhì)醇封閉治療，但無確切療效[8]。

保守治療失敗后，手術(shù)是唯一的選擇。脊柱融合術(shù)是目前應用最廣泛的，但療效存在爭議。瑞典一項為期2年的隨訪研究表明，行脊柱融合術(shù)后的生活質(zhì)量優(yōu)于保守治療[9]；但英國的一項最新研究證明兩者無明顯差異[10]。脊柱融合術(shù)存在多種并發(fā)癥，甚至可能導致臨近節(jié)段椎間盤加速退行性改變[11]。近年來，人工椎間盤置換術(shù)應用于臨床，術(shù)后短期隨訪，患者疼痛緩解顯著[12-13]，但術(shù)后人工椎間盤移位等并發(fā)癥發(fā)生率較高[14]。

以上治療方式均無法修復椎間盤組織。組織工程技術(shù)為修復椎間盤、治療椎間盤退行性改變提供了可能。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞治療

3.1 BMSCs的細胞生物學研究及治療椎間盤退變的可能

目前，干細胞移植治療椎間盤退行性病變中，研究最多的是BMSCs和ADSCs。BMSCs是骨髓內(nèi)造血干細胞以外的非造血干細胞，具有多向分化能力，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等[15]。BMSCs具有免疫原性低、自我復制能力強、取材方便及分離培養(yǎng)較為簡單等優(yōu)點，是較為理想的種子細胞。此外，BMSCs可穩(wěn)定表達 CD44、CD71、CD105、CD120A、CD124 和 CD166等表面抗原，分泌白細胞介素、白血病抑制因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等細胞因子。

Sobajima等[16]將異體BMSCs植入兔退變的腰椎間盤內(nèi)，24周后椎間盤組織切片證實，植入的BMSCs存活并轉(zhuǎn)移至纖維環(huán)內(nèi)，認為BMSCs可以用于椎間盤退行性疾病的治療。Richardson等[17]將BMSCs和溫敏型殼聚糖-甘油磷酸酯凝膠體外復合培養(yǎng)，4周后將BMSCs的標記基因與髓核細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞的標記基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，BMSCs的表型與對照組的表型很相似，且BMSCs分泌的蛋白多糖和膠原的量更接近于髓核細胞。Orozco等[18]將BMSCs植入10位下腰痛患者髓核內(nèi)，隨訪1年，患者腰痛明顯改善，但椎間盤高度無明顯恢復。因此，BMSCs治療椎間盤退行性疾病具有可行性。

3.2 支架材料的選擇

支架材料是治療椎間盤退行性病變的重要組成部分。支架作為載體，用以模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境，提供適當?shù)纳锪W環(huán)境和生物化學信號，促進種子細胞分化并維持表型，有助于移植細胞的黏附、增生、基因表達，并能輔助合成新的、有功能的組織。

支架分為天然生物材料支架和人工合成材料支架，常用的包括：凝膠、殼聚糖、藻酸鹽、膠原、透明質(zhì)酸、磷酸鈣、脫鈣骨基質(zhì)等。凝膠具有溫度敏感性，常溫下呈液體狀，體內(nèi)時（37℃）自行凝結(jié)成膠狀，利于細胞在支架內(nèi)分布，也便于注射移植。另外，凝膠可以模擬髓核組織的膠狀環(huán)境，代替細胞外基質(zhì)的功能，為BMSCs的分化起到支持和保護的作用。體外研究證明，在海藻酸鹽支架上BMSCs可以向髓核樣細胞分化[19]，但是海藻酸鹽支架缺乏機械穩(wěn)定性，不能應用于體內(nèi)移植。Richardson等[21]發(fā)現(xiàn)，BMSCs與殼聚糖-甘油磷酸水凝膠體外復合培養(yǎng)，不需要添加額外誘導物質(zhì)，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Sox-9和聚集蛋白聚糖基因表達水平與髓核細胞相似，ALP檢測證實骨髓間充質(zhì)干細胞不向骨細胞方面分化，且這類支架降解緩慢，具有很好的機械穩(wěn)定性[20]。Sakai等[21]將BMSCs與熱敏水凝膠注射入家兔體內(nèi)，觀察24周發(fā)現(xiàn)，實驗組椎體高度增高91%。Bertolo等[22]將BMSCs分別植入膠原（牛、豬）、凝膠和殼聚糖等三種基質(zhì)中，5周后發(fā)現(xiàn)，膠原組BMSCs相對表達更多的Mrna、膠原-Ⅰ、膠原-Ⅱ以及蛋白聚糖，膠原組和凝膠組細胞成活率較高，膠原組（豬）BMSCs分泌的Ⅱ型膠原與蛋白聚糖的比率更類似于髓核樣細胞，但髓核細胞相關(guān)基因（角蛋白19、PAX1和FOXF1）表達較低。脊索細胞可分泌大量粘多糖、SOX-9、膠原-Ⅱ，Purmessur等[23]將BMSCs在富含脊索細胞的原生組織中培養(yǎng)21 d，發(fā)現(xiàn)BMSCs能很好地向髓核樣細胞分化。See等[24]的研究證明，BMSCs在絲類支架上培養(yǎng)4周后，可以很好地黏附于支架上，細胞數(shù)量無明顯減少，且細胞外基質(zhì)中膠原-Ⅰ顯著減少，膠原-Ⅱ顯著增多，為椎間盤纖維環(huán)修復提供了可能。

椎間盤處于低氧、高乳酸、分解代謝旺盛的特殊內(nèi)環(huán)境中[25]，理想的支架應能夠提供分子信號，誘導BMSCs表型的表達及向髓核樣細胞轉(zhuǎn)化，并兼顧機械負荷因素。

3.3 細胞因子的作用

細胞因子通過內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌系統(tǒng)發(fā)揮功能，調(diào)節(jié)椎間盤細胞的代謝活動。BMSCs向髓核樣細胞分化過程中需要TGF-β、IGF-1和BMP等的參與。

Thompson等[26]首次報道，在體外培養(yǎng)的髓核細胞內(nèi)添加TGF-β，可促進椎間盤細胞分泌蛋白多糖。Gruber等[27]在體外培養(yǎng)的椎間盤髓核細胞內(nèi)添加IGF-1和血小板源性生長因子后可阻止細胞凋亡。WaSh等[28]通過實驗動物大鼠尾椎退變間盤模型發(fā)現(xiàn)，MMPs主要作用于內(nèi)層纖維環(huán)細胞，并可使其向髓核細胞方向分化。研究證明，SOX-9超表達時可促進BMSCs在PLLA支架上的分化、增殖[25]。Robert等[29]對46例腰椎疾病患者分別按退變性椎間盤疾病、椎間盤纖維環(huán)破損、脊椎滑脫和腰椎間盤突出進行分類后取材，應用免疫組化方法檢測基質(zhì)金屬蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)在椎間盤突出病例中基質(zhì)金屬蛋白酶含量最高，提示MMPs可能是椎間盤退變進程的生物調(diào)節(jié)因子，參與了髓核細胞外基質(zhì)的降解。Illien-Jünger等[30]的研究表明，椎間盤的退變環(huán)境也可以誘導細胞因子釋放，促進BMSCs增生以及蛋白聚糖的分泌。

4 問題與展望

應用組織工程方法治療椎間盤退行性病變，尚屬早起研究，還存在很多問題。椎間盤是人體最大的無血管器官，局部營養(yǎng)供應受限，組織含氧量低，局部機械壓力大，移植細胞的存活問題較為突出[31]。研究證明，BMSCs可誘導分化為髓核樣細胞，但髓核細胞與關(guān)節(jié)軟骨細胞存在相同的特異基因，如：MMP-2、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子-1和低氧誘導因子[32]，導致鑒別困難。Hee等[33]的實驗證明，在家兔模型中植入BMSCs可以刺激椎間盤組織再生，但不能恢復穩(wěn)定的椎間盤微環(huán)境，難以達到預期效果。Vadala等[34]將BMSCs注入家兔椎間盤退變模型中，9周后行影像學檢查，發(fā)現(xiàn)椎間盤無明顯再生，而椎體前外側(cè)緣出現(xiàn)明顯骨質(zhì)增生；組織學研究顯示，骨贅表面富含軟骨細胞，來源于注射滲漏的BMSCs。另外，BMSCs的提取、細胞移植方法、移植細胞數(shù)量及適應證等，都是需要積極探索的。

通過組織工程技術(shù)，結(jié)合干細胞、細胞因子及復合支架植入病變椎間盤，修復病變椎間盤，恢復腰椎間隙是研究的目的。隨著對椎間盤的退變機制及干細胞生物學認識的不斷深入，以及新型支架材料、培養(yǎng)條件、細胞移植技術(shù)的研發(fā)，BMSCs從生理功能上修復退變椎間盤、治療退變性椎間盤疾病將具有廣闊的應用前景。

[1] Stewart WF,Ricci JA,Chee E,et al.Lost productive time and cost due to common pain conditions in the US workforce[J].JAMA,2003,290(18):2443-2454.

[2] Sive JI,Baird P,Jeziorsk M,et al.Expression of chon-drocyte markers by cells of normal and degenerate intervertebral discs[J].Mol Pathol,2002,55:91-97.

[3] Zhao CQ,Jiang LS,Dai LY.Programmed cell death in intervertebral disc degeneration[J].Apoptosis,2006,11(12):2079-2088.

[4] Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs:a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration[J].Arthritis Res Ther,2007,9(3):R45.

[5] Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.Localization of degradative enzymes and their inhibitors in the degenerate human intervertebral disc[J].J Pathol,2004,204(1):47-54.

[6] Le Maitre CL,Hoyland JA,Freemont AJ.Interleukin-1 receptor antagonist delivered directly and by gene therapy inhibits matrix degradation in the intact degenerate human intervertebral disc:an in situ zymographic and gene therapy study[J].Arthritis Res Ther,2007,9(4):R83.

[7] Andersson GB.Epidemiological features of chronic low-back pain[J].Lancet,1999,354(9178):581-585.

[8] Nelemans PJ,de Bie RA,de Vet HC,et al.Injection therapy for subacute and chronic benign low back pain[J].Spine,2001,26(5):501-515.

[9] Fritzell P,Hagg O,Wessberg P,et al.2001 Volvo Award Winner in Clinical Studies:Lumbar fusion versus nonsurgical treatment for chronic low back pain:a multicenter randomized controlled trial from the Swedish Lumbar Spine Study Group[J].Spine,2001,26(23):2521-2532.

[10] Fairbank J,Frost H,Wilson-MacDonald J,et al.Randomised controlled trial to compare surgical stabilisation of the lumbar spine with an intensive rehabilitation programme for patients with chronic low back pain:the MRC spine stabilisation trial[J].BMJ,2005,330(7502):1233.

[11] Levin DA,Hale JJ,Bendo JA.Adjacent segment degeneration following spinal fusion for degenerative disc disease[J].Bull NYU Hosp Jt Dis,2007,65(1):29-36.

[12] Blumenthal S,McAfee PC,Guyer RD,et al.A prospective,randomized,multicenter Food and Drug Administration investigational device exemptions study of lumbar total disc replacement with the CHARITE artiicial disc versus lumbar fusion:part I:evaluation of clinical outcomes[J].Spine,2005,30(14):1565-1575.

[13] Bertagnoli R,Yue JJ,Shah RV,et al.The treatment of disabling single-level lumbar discogenic low back pain with total disc arthroplasty utilizing the Prodisc prosthesis:a prospective study with 2-year minimum follow-up[J].Spine,2005,30(19):2230-2236.

[14] Di Martino A,Vaccaro AR,Lee JY,et al.Nucleus pulposus replacement:basic science and indications for clinical use[J].Spine,2005,30(16 Suppl):S16-S22.

[15] Kolf CM,Cho E,Tuan RS.Biology of adult mesenchymal stem cells:regulation of niche,self-renwal and differentiation[J].Arthritis Res Ther,2007,9(1):204-213.

[16] Sobajima S,Vadala G,Shimer A,et al.Feasibility of a stem cell therapy for intervertebral disc degeneration[J].Spine,2008,8(6):888-896.

[17] Richardson SM,Hughes N,Hunt JA,et al.Human mesenchymal stem celldifferentiation to NP-like cellsin chitosanglycerophate hydrogels[J].Biomaterials,2008,29(1):85-93.

[18] Orozco L,Soler R,Morera C,et al.Intervertebral disc repair by autologous mesenchymal bone marrow cells:a pilot study[J].Transplantation,2011,92(7):822-828.

[19] Ma HL,Hung SC,Lin SY,et al.Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads[J].J Biomed Mater Res A,2003,64(2):273-281.

[20] Richardson SM,Curran JM,Chen R,et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(22):4069-4078.

[21] Sakai D,Mochida J,Iwashina T,et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc[J].Biomaterials,2006,27(3):335-345.

[22] Bertolo A,Mehr M,Aebli N et al.Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells[J].Eur Spine J,2012,21(6):S826-S838.

[23] Purmessur D,Schek RM,Abbott RD,et al.Notochordal conditioned media from tissue increases proteoglycan accumulation and promotes a healthy nucleus pulposus phenotype in human mesenchymal stem cells[J].Arthritis Res Ther,2011,13(3):R81.

[24] See EY,Toh SL,Goh JC.Simulated intervertebral disc-like assembly using bone marrow-derived mesenchymal stem cell sheets and silk scaffolds for annulus fibrosus regeneration[J].J Tissue Eng Regen Med,2012,6(7):528-535.

[25] Richardson SM,Walker RV,Parker S,et al.Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation[J].Stem Cells,2006,24(3):707-716.

[26] Thompson JP,Oegema TJ,Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factors[J].Spine,1991,16(3):253-260.

[27] Gruber HE,Norton HJ,Hanley EN Jr.Anti-apoptotic effects of IGF-I and PDGF on human intervertebral disc cells in vitro[J].Spine,2000,25(17):2153-2157.

[28] Walsh AJ,Bradford DS,Lotz JC.In vivo growth factor treatment of egenerated intervertebral discs[J].Spine,2004,29(2):156-163.

[29] Roberts S,Caterson B,Menage J,et a1.Matrix metalloproeinases and aggrecanase:their role in disorders of the human inlervertebral disc[J].Spine,2000,25(23):3005-3013.

[30] Illien-Jünger S,Pattappa G,Peroglio M,et al.Homing of mesenchymal stem cells in induced degenerative intervertebral discs in a whole organ culture system[J].Spine,2012,37(22):1865-1873.

[31] Urban JP,Smith S,Fairbank JC.Nutrition of the intervertebral disc[J].Spine,2004,29(23):2700-2709.

[32] Rajpurohit R,Risbud MV,Ducheyne P,et al.Phenotypic characteristics of the nucleus pulposus:expression of hypoxia inducing factor-1,glucose transporter-1 and MMP-2[J].Cell Tissue Res,2002,308(3):401-407.

[33] Hee HT,Ismail HD,Lim CT,et al.Effects of implantation of bone marrow mesenchymal stem cells,disc distraction and combined therapy on reversing degeneration of the intervertebral disc[J].J Bone Joint Surg Br,2010,92(5):726-736.

[34] Vadala G,Sowa G,Hubert M,et al.Mesenchymal stem cells injection in d egenerated intervertebral disc:cell l eakage may induce osteophyte formation[J].J Tissue Eng Regen Med,2012,6(5):348-355.