胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展

常志剛 田孝東 楊尹默

·綜述與講座·

胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展

常志剛 田孝東 楊尹默

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，其定義為具有極性、緊密連接特性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成獨(dú)立的、具有移行能力、并能侵入細(xì)胞外基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞的過程。EMT的概念最早見于發(fā)育生物學(xué)，主要參與胚胎的發(fā)育、組織重建、創(chuàng)傷愈合、心瓣膜和顱面結(jié)構(gòu)以及肌肉骨骼系統(tǒng)的形成，同時(shí)與多種慢性疾病(如腎纖維化)的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。近年來研究還發(fā)現(xiàn)EMT過程與腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT過程的信號(hào)通路及相關(guān)基因的研究日益受到重視，成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[1]。研究表明，經(jīng)過EMT，腫瘤細(xì)胞在功能上增強(qiáng)了移行能力、基質(zhì)重塑能力及抗凋亡能力，該過程還包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)及基因型的改變[1-3]。而EMT的發(fā)生與多種蛋白分子、微環(huán)境及micro RNA等相關(guān)，涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制。

一、EMT的關(guān)鍵分子：E-鈣黏素

鈣連接素是上皮組織中的一類依賴Ca2+的細(xì)胞間跨膜粘連糖蛋白分子，主要參與細(xì)胞間的連接，分為E-鈣黏素、P-鈣黏素和N-鈣黏素，其中E-鈣黏素對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響最為重要，同時(shí)也是EMT的關(guān)鍵分子。E-鈣黏素可與β-連環(huán)素(β-catenin)和γ-連環(huán)素(γ-catenin)結(jié)合，再與α-連環(huán)素(α-catenin)相連，形成E-鈣黏素-β-連環(huán)素-α-連環(huán)素復(fù)合體[4]，此復(fù)合體再直接連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，用以維持細(xì)胞間黏附的穩(wěn)定性和細(xì)胞極性。細(xì)胞連接復(fù)合體還直接或間接參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)胚胎發(fā)育中的細(xì)胞識(shí)別、遷移、組織分化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有重要作用。在上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化以及腫瘤發(fā)生過程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)E-鈣黏素表達(dá)下調(diào)或E-鈣黏素-連環(huán)素復(fù)合物功能的失調(diào)。E-鈣黏素表達(dá)下調(diào)或抑制可以啟動(dòng)EMT，并導(dǎo)致腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。E-鈣黏素的表達(dá)與腫瘤的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。染色體丟失、基因突變或E-鈣黏素啟動(dòng)子的甲基化都可以降低E-鈣黏素表達(dá)水平。E-鈣黏素缺失的細(xì)胞侵襲性增加，在動(dòng)物模型中可以引起腺瘤向腺癌的轉(zhuǎn)化[4]。

二、胰腺癌EMT的誘發(fā)因素

多種生長因子可調(diào)控EMT，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factors, VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor, TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)等。生長因子與上皮細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，活化不同的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)，最終促進(jìn)EMT的發(fā)生。

1．TGF-β：TGF-β有3種異構(gòu)體TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，均屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長因子超家族，3種TGF-β均可誘導(dǎo)EMT。TGF-β與其受體TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ的β聚糖結(jié)合，磷酸化Smad 2和Smad 3，進(jìn)一步與Smad 4結(jié)合，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核活化轉(zhuǎn)錄基因。也可以通過非Smad分子依賴途徑發(fā)揮作用，包括GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、p38 MAPK途徑、PI3K途徑、TIF-1γ(transcriptional intermediary factor-1γ)等發(fā)揮作用。

TGF-β是胰腺癌發(fā)生EMT的主要誘導(dǎo)因子之一，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)41.4%的胰腺癌患者表達(dá)TGF-β1，血清TGF-β表達(dá)增高與胰腺癌的預(yù)后相關(guān)。體外研究也證實(shí)TGF-β1促進(jìn)胰腺癌PANC1細(xì)胞發(fā)生EMT及侵襲[5]。在含有活化KrasG12D等位基因的胰腺癌小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)靶向抑制TGF-β信號(hào)通路下游分子可消除EMT，癌細(xì)胞出現(xiàn)囊性、腺體樣分化較好的表型，且?guī)谉o轉(zhuǎn)移能力[6]。

通過建立TGF-β誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因高表達(dá)的PANC1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)表達(dá)顯性陰性的HrasS17N突變的細(xì)胞系無EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而表達(dá)持續(xù)活化的KrasG12V突變的細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)增加[7]。利用特異性MEK1抑制劑PD98059(特異性抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK-1和-2的活性)干預(yù)PANC1、Colo-357和IMIM-PC1細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力增加并伴隨中度持續(xù)性ERK2活化。上述發(fā)現(xiàn)提示Kras介導(dǎo)活化MEK-ERK信號(hào)途徑在TGF-β誘導(dǎo)的胰腺癌EMT中起著重要作用。

Gordon等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中伴隨Ⅲ型TGF-β受體(TβRⅢ)下調(diào)，提示TβRⅢ對(duì)EMT起負(fù)調(diào)節(jié)作用。作者發(fā)現(xiàn)TβRⅢ缺失是TGF-β誘導(dǎo)EMT發(fā)生的必要因素，TβRⅢ表達(dá)缺失可能是胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵事件。

2．HGF：HGF是c-Met原癌基因跨膜酪氨酸激酶受體的配體。HGF及其受體c-Met在人類胰腺癌組織中呈高表達(dá)，且HGF可通過c-Met途徑促進(jìn)胰腺癌Colo-357細(xì)胞系的侵襲[9]。穩(wěn)定敲除人胰腺癌SUIT-2細(xì)胞系HGF活化抑制劑-1基因(HGF activator inhibitor-1, HAI-1)可誘導(dǎo)EMT，并伴隨SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein 1，Smad相互作用蛋白1)表達(dá)增加，E-鈣黏素表達(dá)下調(diào)；相反HAI-1過表達(dá)則可增加E-鈣黏素的表達(dá)并恢復(fù)上皮表型[10]。

c-Met相關(guān)酪氨酸激酶受體RON/MSTR1在93%人類胰腺癌組織中呈高表達(dá)，且在所有人類胰腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)[11]。體外研究[11]用RON配體MSP/MST1(巨噬細(xì)胞刺激蛋白macrophage stimulating protein)處理胰腺癌L3.6pl細(xì)胞，可使該細(xì)胞發(fā)生EMT，伴隨ERK磷酸化增加、E-鈣黏素表達(dá)下降、β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)位、細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力增加等。相反，同時(shí)應(yīng)用RON單克隆抗體孵育，則可抑制L3.6pl細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RON單克隆抗體可顯著抑制皮下及原位腫瘤的生長。因此RON和c-Met均可作為HGF誘發(fā)胰腺癌細(xì)胞侵襲的潛在治療靶點(diǎn)。

3．BMPs：BMP家族中，BMP-2、BMP-4和BMP-7可以誘發(fā)PANC1細(xì)胞的EMT，如下調(diào)E-鈣黏素、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力等，其提高侵襲能力的作用機(jī)制可能是由于增強(qiáng)了基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)和活性[12]。BMP可下調(diào)胰腺癌進(jìn)展過程中TβRⅢ的表達(dá)，該過程需要Smad1參與[12]。BMP4可誘導(dǎo)同源框基因MSX2的表達(dá)，后者與胰腺癌的EMT相關(guān)，滅活MSX2基因則可抵消BMP誘發(fā)的EMT，因此BMP4可通過誘導(dǎo)MSX2基因引起EMT改變從而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。

4．VEGF：VEGF-α和VEGF-β通過結(jié)合受體VEGFR1促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲及EMT。用VEGF蛋白處理L3.6pl細(xì)胞，后者呈紡錘形改變，并失去細(xì)胞極性，出現(xiàn)偽足[13]。VEGFR1交聯(lián)可促進(jìn)E-鈣黏素及β-catenin分別向細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。激活VEGFR1可下調(diào)E-鈣黏素和盤狀球蛋白(plakoglobin)的表達(dá)，并上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物如波動(dòng)蛋白、N-鈣黏素以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist和Slug等的表達(dá)。

三、EMT相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1．SMAD/STAT3通路：到目前為止，Smad通路是研究最為透徹的TGF-β下游信號(hào)通路。Smad蛋白超家族由受體調(diào)節(jié)Smad1～7組成。TGF-β與受體結(jié)合后，Smad 2和Smad 3通過其C末端SSXS模體磷酸化而活化，進(jìn)而與Smad 4形成同型及異型復(fù)合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。滅活編碼Smad4蛋白的DPC4基因可抑制TGF-β介導(dǎo)的EMT，進(jìn)一步抑制KrasG12DInk4aKO鼠胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]，并出現(xiàn)上皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)、上皮標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白-19的持續(xù)表達(dá)及間質(zhì)標(biāo)志物波動(dòng)蛋白的下調(diào)等。

Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3是胰腺癌EMT的必要因子，Smad4對(duì)STAT3誘發(fā)EMT起負(fù)調(diào)節(jié)作用。敲除Smad4則可致STAT3的異常激活，使TGF-β促腫瘤通路占優(yōu)勢[15]。與STAT3在胰腺癌EMT中的關(guān)鍵作用一致，其下游因子LIV-1可調(diào)節(jié)EMT關(guān)鍵因子Snail的核轉(zhuǎn)位。敲除LIV-1的PANC1細(xì)胞Snail核轉(zhuǎn)移減少、E-鈣黏素上調(diào)，且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖能力下降，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移能力下降。

2．Ras/ERK1/2通路：K-ras突變?cè)谌祟愐认侔┲袕V泛存在。利用胰腺特異性彈性酶-1和Pdx1啟動(dòng)子將等位基因K-rasG12D轉(zhuǎn)入小鼠胰腺，小鼠發(fā)生胰腺導(dǎo)管內(nèi)瘤性病變(pancreatic intraductal neoplastic lesions，PanINs)，其中25%進(jìn)展為侵襲性胰腺癌。導(dǎo)入Pdx1-KrasG12D等位基因同時(shí)敲除p53或者p16/p19Ink4a可致其充分癌變，并100%具有侵襲性，動(dòng)物模型在12周內(nèi)死亡[14]。研究還發(fā)現(xiàn)RasG12V或ERK2的過表達(dá)可致MCF-10A乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT[16]，用shRNA敲除ERK2后可抵消RasG12V誘導(dǎo)的EMT，提示兩者之間存在相互作用。在胰腺癌中ERK的活化與EMT呈正相關(guān)，且與患者的預(yù)后相關(guān)。BMP4誘導(dǎo)MSX2同源框基因依賴于ERK和p38 MAPK通路的激活以及Smad蛋白的表達(dá)[17]。

3．轉(zhuǎn)錄因子：SNAI1/Snail、SNAI2/Slug、ZEB1/δEF1/ZFHX1A、ZEB2/SIP1/ZFHX1B、TWIST1/TWIST以及TWIST2/DERMO1均是EMT的重要調(diào)控因子，主要通過抑制CDH1/E-鈣黏素來促進(jìn)腫瘤相關(guān)的EMT，其次尚可調(diào)節(jié)一些上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如Claudins、Cytokeratins、Cadherins、Occluding以及ZO蛋白等[18]。

Snail是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，與SIP1競爭性結(jié)合E-鈣黏素啟動(dòng)子部位的E-box連接基序，抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)波形蛋白(Vimentin)表達(dá)上升，引起上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變[19]。在MDCK(madin-darby canine kidney) 上皮細(xì)胞中，Snail與E-鈣黏素的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，缺乏E-鈣黏素的癌細(xì)胞出現(xiàn)大量的Snail，將Snail轉(zhuǎn)染至E-鈣黏素陽性的細(xì)胞可以導(dǎo)致細(xì)胞E-鈣黏素表達(dá)水平的下降，并表達(dá)出波形纖維蛋白等間質(zhì)標(biāo)記物，從而導(dǎo)致細(xì)胞EMT的發(fā)生[2]。Snail調(diào)節(jié)的靶基因數(shù)目眾多、功能廣泛，被稱為細(xì)胞EMT的“開關(guān)”。

Slug和Snail同屬于鋅指蛋白Snail超家族，在雞原腸胚形成過程中，Slug也可以下調(diào)E-鈣黏素的表達(dá)[1]。

四、微環(huán)境與細(xì)胞外基質(zhì)

上皮細(xì)胞從同類細(xì)胞之間以及基底膜上的解離與周圍基質(zhì)的重構(gòu)關(guān)系密切。細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM)在細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，間質(zhì)表型更易與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生黏附。細(xì)胞外基質(zhì)及其相關(guān)酶類的改變，可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖、外形改變并獲得轉(zhuǎn)移能力。由于ECM是間充質(zhì)細(xì)胞分泌的，因此，上皮細(xì)胞分泌ECM可以看作其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)證據(jù)。同時(shí)，發(fā)生EMT改變的細(xì)胞會(huì)分泌大量的ECM及其酶類，這可促使其從原位逸出。

MMPs是一類鋅肽酶超家族，具有降解ECM成分的能力，是目前已知唯一能降解膠原纖維的酶類。膠原蛋白、層黏連蛋白、纖維連接蛋白等都是它的作用底物。腫瘤細(xì)胞本身表達(dá)MMPs的同時(shí)還能直接刺激宿主成纖維細(xì)胞大量表達(dá)MMPs。在胰腺癌PANC1細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，BMP可通過MMP-2促進(jìn)細(xì)胞EMT，增加侵襲能力[20]。

五、MicroRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約18～24個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。主要通過與mRNA 3′非翻譯區(qū)域配對(duì)，抑制翻譯和(或)促進(jìn)降解。miRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及疾病的發(fā)生中扮演重要的角色。

最先在MDCK細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miRNAs在EMT用TGF-β誘導(dǎo)或者蛋白酪氨酸磷酸酶Pez過表達(dá)引起的EMT中起調(diào)節(jié)作用[21]。EMT與miR-200、miR-205表達(dá)下調(diào)有關(guān)。miR-200b、200a、429的持續(xù)表達(dá)可以完全阻止TGF-β誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞發(fā)生EMT。此外，多項(xiàng)研究[21-22]顯示，miR-200家族(如miR-141、miR-200c)可顯著下調(diào)TGF-β對(duì)EMT的作用，miR-200直接作用于(抑制)ZEB1及SIP1的mRNA，上調(diào)胰腺癌細(xì)胞系中E-鈣黏素的表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生。Brabletz等發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞EMT中，ZEB1可下調(diào)miR-200家族成員miR-141和miR-200c的表達(dá)，而ZEB1和TGF-β又是miR-200家族的靶基因，提示它們之間存在負(fù)調(diào)節(jié)反饋環(huán)。

其他的一些miRNA如miRNA-10b可以上調(diào)HOXD10基因的翻譯、下調(diào)RhoC的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而Twist可以促進(jìn)miRNA-10b的轉(zhuǎn)錄[23]。另外在人類皮膚癌角化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種EMT特異性miRNA：miR-21。目前認(rèn)為miR-21是一種腫瘤基因，可以抑制原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)和程序性死亡4基因( PDCD4)兩種抑癌基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，EMT在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，與多種蛋白分子、微環(huán)境及miRNA等相關(guān)，并涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制。近年研究表明，吉西他濱、5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥與胰腺癌細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)[22]，并與調(diào)節(jié)因子ZEB1和Notch-2等調(diào)節(jié)因子相關(guān)。研究胰腺癌的EMT有可能為胰腺癌的輔助治療提供潛在的藥物靶點(diǎn)。

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2012-08-06)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.020

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172184)

100034 北京，北京大學(xué)第一醫(yī)院外科(常志剛、田孝東、楊尹默)；衛(wèi)生部北京醫(yī)院外科(常志剛)

楊尹默，Email:yangyinmo@263.net