環(huán)境相關(guān)濃度下的藥物對大型蚤的多代慢性毒性

楊曉凡,陸光華,劉建超,閆振華

(1.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210098；2.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

由于人類的活動,大量的藥物污染物進入水環(huán)境系統(tǒng)[1],雖不像常規(guī)有機污染物般難降解,易產(chǎn)生脅迫效應(yīng)[2],但是持續(xù)不斷地向水環(huán)境釋放會造成“假持久性”,并對水生生物及水生生態(tài)構(gòu)成潛在的威脅[3-4].藥物數(shù)量巨大,種類繁多,包括抗生素、非甾體類抗炎藥、鎮(zhèn)痛劑、降血脂類和β-受體阻滯劑等等[5].作為PPCPs(藥物和個人護理品)主要組成部分,藥物被列為新興污染物[4,6].國內(nèi)外抗生素和非甾體抗炎藥的檢出頻繁,之前對中國環(huán)太湖流域的藥物應(yīng)用調(diào)查表明磺胺甲惡唑(磺胺類抗生素)、氧氟沙星(喹諾酮)和布洛芬(非甾體類抗炎藥)使用量大,應(yīng)用頻繁,檢出頻率和檢出量(表1)尤其突出,因此在本研究中被列為“優(yōu)先污染藥物”進行研究.

表1 磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬理化性質(zhì)及水體殘留Table 1 Physico-chemical properties of sulfamethoxazole, ibuprofen and ofloxacin and their residue in water

大型蚤(D. magna)具有繁殖快、敏感性高的特點,往往在低于致死濃度幾個數(shù)量級的條件下,仍能觀察到有毒化合物的慢性毒性效應(yīng)[12].已有藥物對大型蚤毒性的研究上,偏重急性毒性研究[13-14].磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤慢性毒性研究較少,而且慢性毒性研究主要集中于兩代以內(nèi)的研究[12,15].Ahlers等[16]認(rèn)為只有通過長期的生活史暴露研究才能確切認(rèn)知化合物的慢性毒性.

研究表明,黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)暴露于1.0ng/L乙炔基雌二醇會產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)[17],但是在英國的地表水中檢測到最高乙炔基雌二醇濃度為 3.4ng/L[18].以現(xiàn)實水環(huán)境中檢出的藥物濃度作為環(huán)境相關(guān)濃度研究的起點,對篩選出的“優(yōu)先藥物污染物”進行相關(guān)慢性毒性研究,更具有現(xiàn)實意義和代表性.因此本研究以大型蚤為模式生物,研究在環(huán)境相關(guān)濃度下,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬單一暴露和復(fù)合暴露對連續(xù) 6代的大型蚤生殖和生長的影響,分析濃度效應(yīng)和各代差異,為藥物污染物對大型蚤的生態(tài)風(fēng)險效應(yīng)評估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬純度＞98%(和光化學(xué)工業(yè)有限公司,日本).根據(jù)自然水體各藥物實際最大檢測濃度作為參考(表1),設(shè)定環(huán)境相關(guān)濃度的起點.磺胺甲惡唑濃度依次為0.8,8.0,80.0μg/L,氧氟沙星濃度依次為 2.0,20.0,200.0μg/L,布洛芬濃度依次為 9.0,90.0,900.0μg/L.復(fù)合暴露處理分別為M1 (M1=0.8μg/L磺胺甲惡唑+2.0μg/L 氧氟沙星+9.0μg/L 布洛芬) 、M2(8.0μg/L 磺 胺 甲 惡 唑+20.0μg/L 氧 氟 沙 星+90.0μg/L布洛芬)和 M3 (80.0μg/L磺胺甲惡唑+200.0μg/L氧氟沙星+900.0μg/L 布洛芬).用超純水溶解制備藥物儲備液.

1.2 化學(xué)分析

在暴露期間,采用液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1260 UHPLC6460 QQQ三重四極質(zhì)譜儀)檢測藥物的實際暴露濃度,3次重復(fù).高濃度測試液過0.45μm玻璃纖維膜后直接分析,低濃度應(yīng)用HLB萃取小柱(500 mg,6mL,Waters)富集、凈化后分析.HLB萃取小柱經(jīng)過6mL甲醇(2′3mL)和6mL超純水(2′3mL)平衡,取 500mL含藥測試液,用1.0M HCl酸化至pH=3,以15mL/min的速度過柱.完成后繼續(xù)抽氣保持真空 5min,排除多余的水份.采用6mL(3′2mL)甲醇以0.5mL/min速度洗脫目標(biāo)藥物.收集的洗脫液用N2(99.999%)吹脫,酸化乙腈/水(10/90, 0.01%甲酸)定容至1.0mL,冷藏待測.液質(zhì)分析使用 C18(2.1mm ′50mm, 1.7μm)色譜柱,ESI源.采用多參數(shù)水質(zhì)測量儀測定溶解氧(DO)和pH值.

1.3 測試生物

大型蚤(Daphnia magna)由中國疾病控制和預(yù)防中心提供,喂食斜生柵藻(Scenedesmus obliquus).斜生柵藻由中科院武漢水生生物研究所提供.M4培養(yǎng)液[19]培養(yǎng)斜生柵藻和大型蚤.大型蚤和斜生柵藻置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度(20±1)℃,光照與黑暗比 16h： 8h.培養(yǎng)液每周更換2 次,保持投藻密度為(2～3)′105cells/mL.

1.4 多代實驗

為了減少對蚤的損傷,實驗中用玻璃滴管轉(zhuǎn)移測試蚤.選擇近百個健康的同齡母蚤培養(yǎng),產(chǎn)生的同期大量的第三窩幼蚤(出生時間6～24h內(nèi))作為母蚤(F0)開始多代試驗.隨機挑選出1個新生的幼蚤,即F0代,放在內(nèi)盛50mL測試液的小燒杯中,每個處理20個平行.不加藥的測試液作空白對照.小燒杯用聚乙烯膜覆蓋,阻止培養(yǎng)液蒸發(fā).膜上戳數(shù)孔,保持一定的氣體交換.測試液每3d更換1次,投藻密度為(2～3)′105cells/mL.每天早晚間隔12h觀察一次.記錄下每個蚤的第一次產(chǎn)卵時間和第一次產(chǎn)卵數(shù)量.F0代產(chǎn)卵后,采用解剖顯微鏡測量產(chǎn)卵后的母蚤體長,復(fù)眼的上緣至尾部基端定義為大型蚤的體長.從產(chǎn)下的幼蚤中隨機選擇一個作為F1代,繼續(xù)培養(yǎng).重復(fù)上述操作,直到F5代產(chǎn)卵后結(jié)束.對沒有在正常時間產(chǎn)卵的大型蚤進行性別觀察,記錄死亡的大型蚤.

1.5 統(tǒng)計分析

采用 SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計學(xué)分析.結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示,處理組與對照組用t檢驗法進行顯著性水平的分析(P＜0.05).

2 結(jié)果

磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬的測試液實測濃度值分別為預(yù)設(shè)濃度的 82.4%～97.3%,95.3%～107%和86.4%～96.7%,與預(yù)設(shè)值具有較好的一致性,在實驗分析中把預(yù)設(shè)濃度定為實際暴露濃度.溶解氧保持在(8.6±0.2)mg/L,pH 值為7.9±0.1.實驗過程中,各處理組沒有發(fā)現(xiàn)雄性蚤,且大型蚤死亡率均小于10%.

2.1 藥物對產(chǎn)卵時間影響

以大型蚤孤雌生殖世代為橫坐標(biāo),以第一次產(chǎn)卵時間為縱坐標(biāo),分析磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬單一及復(fù)合暴露對產(chǎn)卵時間的影響.與對照相比,磺胺甲惡唑(圖 1a)、氧氟沙星(圖 1b)處理中, 連續(xù)6代的大型蚤第一次產(chǎn)卵時間沒有表現(xiàn)出明顯差異性.9.0μg/L和90.0μg/L的布洛芬處理(圖 1c)對大型蚤第一次產(chǎn)卵時間無影響,而900.0μg/L的布洛芬處理總體上延長了第一次產(chǎn)卵時間.與對照相比, F3和F4代產(chǎn)卵時間的延長尤為顯著.在連續(xù)6代的培養(yǎng)中,布洛芬對大型蚤第一次產(chǎn)卵時間的影響表現(xiàn)出了一定的濃度依賴性和世代差異性.

對比混合暴露組(圖 1d)與對照組,低濃度(M1)的混合藥物對各子代大型蚤第一次產(chǎn)卵時間沒有顯著差影響,較高濃度(M2和 M3)的混合藥物延長了大型蚤第一次產(chǎn)卵時間,并且 M2處理在F4代表現(xiàn)出顯著差異性,M3處理在F2、F4和F5代表現(xiàn)出顯著差異性.結(jié)果表明藥物混合物對大型蚤第一次產(chǎn)卵時間表現(xiàn)出了一定的濃度依賴性和世代差異性.與布洛芬單一暴露相比,混合暴露對子代大型蚤第一次產(chǎn)卵時間的影響表現(xiàn)為受顯著影響子代數(shù)增加,并有所提前.基于磺胺甲惡唑和氧氟沙星暴露對子代大型蚤的第一次產(chǎn)卵時間無顯著影響,可以認(rèn)為混合物中對大型蚤第一次產(chǎn)卵時間的影響主要由布洛芬產(chǎn)生,并因為磺胺甲惡唑和氧氟沙星的存在,增強了這種產(chǎn)卵延遲效應(yīng).

圖1 藥物單一及復(fù)合暴露對6代大型蚤第一次產(chǎn)卵時間的影響Fig.1 Effects on the age of first reproduction of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

2.2 藥物對產(chǎn)卵數(shù)量影響

與對照相比,3種濃度的磺胺甲惡唑(圖 2a)在 6代中均沒有對大型蚤的產(chǎn)卵數(shù)量產(chǎn)生明顯的影響.200.0μg/L的氧氟沙星在F3和F4代顯著降低了產(chǎn)卵數(shù)量,但在 F5代又恢復(fù)了正常,產(chǎn)卵數(shù)量甚至超過了對照.900.0μg/L的布洛芬在F3、F4和 F5代顯著降低了產(chǎn)卵數(shù)量.在較高的環(huán)境相關(guān)濃度下,200.0μg/L的氧氟沙星和 900.0μg/L的布洛芬對大型蚤的產(chǎn)卵數(shù)量上表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性和世代差異性.

對比混合暴露與對照(圖 2d),低濃度(M1)混合物對各子代大型蚤第一次產(chǎn)卵數(shù)量無顯著差影響,較高濃度(M2和 M3)的混合藥物總體上降低了子代的產(chǎn)卵數(shù)量.M2處理在F3和F4代表現(xiàn)出顯著差異性.M3處理在F2、F3和F5代表現(xiàn)出顯著差異性.值得注意的是 M2 處理在 F5代又恢復(fù)了正常,這種現(xiàn)象類似于 200.0μg/L的氧氟沙星在子代中的表現(xiàn)(圖1d).另外,M3在F4代產(chǎn)卵數(shù)有所恢復(fù),但在 F5代又顯著降低.結(jié)果表明藥物混合物對大型蚤第一次產(chǎn)卵數(shù)量表現(xiàn)出了一定的濃度依賴性和世代差異性.從最高濃度上看,氧氟沙星和布洛芬均在F3代開始表現(xiàn)顯著差異性,混合藥物暴露在F2開始表現(xiàn)顯著差異性,而且受顯著影響的世代增加,說明混合暴露加劇了對產(chǎn)卵數(shù)量的影響.

2.3 體長影響

由圖3可見,在連續(xù)6代的培養(yǎng)中,磺胺甲惡唑、氧氟沙星、布洛芬單一及混合暴露對大型蚤體長影響不明顯,與對照組比較,無顯著性差異.但在兩個混合暴露M2和M3處理中,隨著培養(yǎng)世代的進行,大型蚤的體長在F3、F4和F5代呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,但與對照組沒有顯著差異.總之,在環(huán)境相關(guān)濃度下,大型蚤體長變化不顯著,表明大型蚤體長不是藥物暴露響應(yīng)的敏感指標(biāo).

圖2 藥物單一及復(fù)合暴露對6代大型蚤第一胎產(chǎn)卵數(shù)量的影響Fig.2 Effects on the number of offsprings of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

3 討論

本試驗發(fā)現(xiàn)氧氟沙星和布洛芬在環(huán)境相關(guān)濃度下,對大型蚤繁殖的影響存在世代差異.可能的原因是藥物暴露濃度較低,單代或短時間的暴露對大型蚤繁殖的影響輕微.但是通過連續(xù)地世代培養(yǎng),造成藥物在生物體內(nèi)累積,產(chǎn)生的生物效應(yīng)在不斷地進行世代疊加,最終在后代中表現(xiàn)出遲發(fā)性慢性毒性效應(yīng),因此表現(xiàn)出慢性毒性的世代差異性.藥物對水生動物的慢性毒性的世代差異已有相關(guān)報道,Brennan等[20]研究發(fā)現(xiàn)暴露于0.2～0.5mg/L的己烯雌酚的大型蚤第二代產(chǎn)仔總量顯著降低,而對第一代產(chǎn)仔總量卻沒有影響.Vandenbergh等[21]研究發(fā)現(xiàn)暴露于 0.1,0.32μg/L 17α-乙炔雌二醇的片腳類動物雄性端足蟲(Hyalella azteca)第二代體長明顯小于第一代.本研究發(fā)現(xiàn),在呈現(xiàn)世代差異的各處理組中,除了900.0μg/L的布洛芬自F3代起連續(xù)三代顯著影響了大型蚤的第一次產(chǎn)卵數(shù)量(圖 1c),其他處理組對大型蚤的第一次產(chǎn)卵時間和第一次產(chǎn)卵數(shù)量的影響不具有世代連續(xù)性(圖1c、圖1d、圖2b和圖2d),在顯著影響一代或兩代后,有恢復(fù)的傾向,其中 200.0μg/L的氧氟沙星和復(fù)合暴露M2處理在 F5代的表現(xiàn)尤其明顯(圖 2b和圖2d).Guan等[22]在研究重金屬污染對大型蚤世代影響中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象.可能的解釋是大型蚤在連續(xù)承受污染物壓力后而在后面世代上產(chǎn)生的一種生殖恢復(fù)或生殖補償機制,從而增加后代的存活機率.本研究中,相對于生殖指標(biāo),生長指標(biāo)—體長對藥物暴露響應(yīng)不敏感.這與Li等[23]的研究類似,低濃度的三唑磷和毒死蜱對大型蚤體長無影響,而對后代數(shù)量有明顯的抑制效應(yīng).

圖3 藥物單一及復(fù)合暴露對6代大型蚤母蚤體長的影響Fig.3 Effects on bodylength of D. magna exposed to sulfamethoxazole, ibuprofen, ofloxacin and drug mixture for six generations

在環(huán)境相關(guān)濃度下,磺胺甲惡唑?qū)Υ笮驮楦鞔牡谝淮萎a(chǎn)卵時間、第一胎產(chǎn)卵數(shù)及母體體長等指標(biāo)均沒有觀察到明顯變化.Flaherty等[12]也發(fā)現(xiàn)暴露于10μg/L磺胺甲惡唑30d后,大型蚤的體長、繁殖力及性別比沒有明顯的差異.多代試驗進一步證明了環(huán)境相關(guān)濃度下的磺胺甲惡唑?qū)Υ笮驮榈姆N群發(fā)展風(fēng)險較低,具有較高的生態(tài)安全性.相對于磺胺甲惡唑,氧氟沙星和布洛芬對大型蚤的種群發(fā)展風(fēng)險較高.喹諾酮類抗菌藥物能夠抑制主要致病菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶活性[24],在水環(huán)境中不易降解[25],被列為基因毒性污染物[26].因此作為喹諾酮類抗菌藥物的典型代表,氧氟沙星可能對大型蚤具有基因遺傳毒性.Parolini等[27]發(fā)現(xiàn) 0.2μg/L布洛芬能夠引起斑馬貽貝(Dreissena polymorpha)輕微的細(xì)胞遺傳毒性,較高濃度能夠顯著引起基因和細(xì)胞傷害.在哺乳動物體中,布洛芬能阻斷多種類花生酸的生成,在炎癥調(diào)控、離子傳輸及神經(jīng)功能中起到重要作用[28-29].近來的研究表明類花生酸在昆蟲的繁殖、免疫反應(yīng)及溫度調(diào)節(jié)中起重要作用[30-31].因此,類花生酸在無脊椎動物大型蚤體內(nèi)的含量及作用,以及布洛芬是否會因影響類花生酸物質(zhì)的合成而影響大型蚤的生殖和生長值得深入的研究.

以第一次產(chǎn)卵數(shù)量和第一次產(chǎn)卵時間作為觀察指標(biāo),通過對大型蚤的6代效應(yīng)研究,得出3種藥物對大型蚤的最高無影響濃度(NOEC)和最低影響濃度(LOEC)(表 2),根據(jù) NOEC和 LOEC的幾何平均值推導(dǎo)出預(yù)測無影響濃度(PNEC).參考?xì)W洲藥品局(EMEA)人用藥物環(huán)境風(fēng)險評估指南[32],采用檢測環(huán)境濃度(MEC)與預(yù)測無影響濃度(PNEC)的比值來評價現(xiàn)實環(huán)境中藥物暴露生態(tài)風(fēng)險.本研究得到的3種藥物的MEC/PNEC比值均小于 1,表明目前文獻報道的水體中殘留的磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤種群發(fā)展的生態(tài)風(fēng)險較低,具有較高的安全性.

本試驗中,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬分別以最高無影響濃度存在的復(fù)合處理 M2,在某些世代中表現(xiàn)明顯的慢性生殖毒性.各藥物以無影響濃度共同存在時,能夠發(fā)現(xiàn)混合暴露影響增強,這種現(xiàn)象也說明不能以單一藥物的 NOEC預(yù)測藥物復(fù)合污染濃度,藥物混合污染生態(tài)毒性預(yù)測值得進一步研究.

表2 磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤的生態(tài)毒性參數(shù)Table 2 Ecological toxicity parameters of sulfamethoxazole, ibuprofen and ofloxacin

4 結(jié)論

4.1 通過連續(xù)6代的暴露試驗,磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬在環(huán)境相關(guān)濃度下對大型蚤的生長和繁殖沒有顯著影響.

4.2 隨著暴露濃度的提高,布洛芬和氧氟沙星明顯延遲了大型蚤的第一次產(chǎn)卵時間,減少了第一次產(chǎn)卵數(shù)量,而且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性和世代差異性.

4.3 藥物混合物對大型蚤繁殖的影響更為顯著.大型蚤體長對藥物暴露(單一或混合)的效應(yīng)不敏感.

4.4 風(fēng)險評估結(jié)果表明,目前水體中殘留的磺胺甲惡唑、氧氟沙星和布洛芬對大型蚤種群發(fā)展的生態(tài)風(fēng)險較低.

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