高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定植煙土壤和水中3種除草劑殘留量

丁春霞，龔道新，肖 浩，任穎俊，楊麗華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，長(zhǎng)沙 410128）

農(nóng)田雜草對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，隨著除草劑品種的日益增多，新的除草劑不斷用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此環(huán)境樣品中常常含有多種除草劑的殘留組分，除草劑殘留分析方法也逐漸由單一種類除草劑的檢測(cè)向多種除草劑多殘留分析發(fā)展[1]。高效氟吡甲禾靈、精吡氟禾草靈及精喹禾靈是一類芳氧苯氧丙酸酯類除草劑[2]，屬于內(nèi)吸傳導(dǎo)型莖葉處理除草劑，被廣泛用于煙草、油菜、花生、馬鈴薯、大豆、番茄等多種闊葉作物地中，防除馬唐、狗尾草、稗草、牛筋等多種一年生和多年生禾本科雜草，除草活性高[3]。但隨著此類除草劑的廣泛使用，它對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的不利影響也日趨增多[4-9]。因此，建立一套能同時(shí)檢測(cè)該類除草劑在環(huán)境中殘留量的分析與檢測(cè)方法就顯得十分必要。目前，對(duì)于這類除草劑的單劑在環(huán)境及作物中的殘留檢測(cè)方法已有一些報(bào)道，主要的分析檢測(cè)方法有氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、高效液相色譜法[12-14]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[15]、酶聯(lián)免疫法[16-17]等。但尚未見(jiàn)有這3種除草劑在環(huán)境樣品中同時(shí)分析與檢測(cè)的報(bào)道。筆者通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件及其分析檢測(cè)條件的摸索，建立了一種能同時(shí)測(cè)定植煙土壤及其周邊水樣中精喹禾靈、高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司），SHZ-D型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華有限責(zé)任公司），RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞帶生化儀器廠），2HWY-2102型雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

甲醇為色譜純，二氯甲烷、丙酮、乙腈、氯化鈉均為分析純。

高效氟吡甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度為95.3%）、精吡氟禾草靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度為94.8%）均由山東綠霸化工股份有限公司提供；精喹禾靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度為96.7%）由湖南化工研究院提供。土壤樣品采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草基地，樣品經(jīng)風(fēng)干后磨碎過(guò) 20目篩；水樣采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草基地附近的池塘和水渠。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取高效氟吡甲禾靈、精吡氟禾草靈及精喹禾靈的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確吸取一定量各種農(nóng)藥的儲(chǔ)備液，用甲醇梯度稀釋法配制質(zhì)量濃度分別為0.0050、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品的提取與凈化

1.3.1 植煙土壤 準(zhǔn)確稱取植煙土壤樣品20.0 g，置于250 mL具塞三角瓶中，加入60 mL丙酮，在恒溫振蕩器中震蕩提取 30 min，減壓抽濾，再用60 mL丙酮分2次洗滌殘?jiān)统闉V瓶，合并濾液，無(wú)損轉(zhuǎn)入250 mL具塞三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干后，用5 mL二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）混合液溶解，然后將其無(wú)損轉(zhuǎn)移入經(jīng)10 mL二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）混合液預(yù)淋洗過(guò)的弗羅里硅土凈化柱中，用60 mL二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）混合液洗脫，收集全部洗脫液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮近干，用色譜甲醇溶解并定容至5.0 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，待HPLC檢測(cè)。

1.3.2 水 準(zhǔn)確量取100.0 mL已制備好的水樣置于500 mL分液漏斗中，向其中加入20 mL10%的氯化鈉水溶液，再加入5 mL丙酮，搖勻，分別用40、40、20 mL二氯甲烷液萃取3次，合并二氯甲烷萃取相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干；用甲醇溶解并定容至5.0 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，待HPLC檢測(cè)。

1.4 HPLC條件

色譜柱：Hypersid-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（85:15，v:v）；流速0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

1.5 添加回收率實(shí)驗(yàn)

植煙土壤添加回收率：準(zhǔn)確稱取空白植煙土壤20.0 g，用3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至0.050、0.50、1.0 mg/kg三個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)5次，按照1.3.1前處理方法處理，按照1.4的色譜操作條件進(jìn)行測(cè)定；水的添加回收率：取空白水100 mL過(guò)濾，用3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至0.0050、0.10、1.0 mg/L三個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)5次。按照1.3.2前處理方法處理，按照1.4的色譜操作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 提取溶劑的選擇

分別比較了甲醇、乙腈、丙酮以及二氯甲烷作為提取溶劑對(duì)植煙土壤中的精喹禾靈、高效氟吡甲禾靈及精吡氟禾草靈的提取效果。結(jié)果表明，用甲醇和二氯甲烷提取時(shí)，有雜質(zhì)峰干擾測(cè)定，而且精吡氟禾草靈的回收率低于50%；乙腈提取時(shí)，雖然雜質(zhì)較少，但提取率低；而采用丙酮作為提取劑時(shí)，3種除草劑的提取率均有較大的提高，但有雜峰干擾，需進(jìn)一步凈化。因此，對(duì)植煙土壤中3種除草劑的提取選丙酮作為提取溶劑。

在對(duì)水樣進(jìn)行前處理時(shí)，選用二氯甲烷在對(duì)水中目標(biāo)物進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有精喹禾靈的回收率較高（80%～101%），而另外兩種目標(biāo)物的回收率均低于70%，后通過(guò)往萃取體系中加入5%的丙酮后，3種目標(biāo)物的回收率均有較大的提高，回收率均為88.9%～101.2%。這可能是因?yàn)楸募尤肟梢允苟燃淄樵谒嘀蟹稚⒊杉?xì)小的液滴，增大其與待萃取物的接觸面積，從而提高萃取效率。因此，水樣用二氯甲烷萃取時(shí)需加入5%的丙酮作為分散劑。

2.2 柱凈化條件的選擇

分別以二氯甲烷-甲醇（3:1，v:v）、二氯甲烷-甲醇（5:1，v:v）、二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）以及二氯甲烷-丙酮（5:1，v:v）作為柱淋洗液，考察其對(duì)3種除草劑與雜質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，用二氯甲烷-甲醇作為洗脫液時(shí)，有一雜質(zhì)峰干擾對(duì)精吡氟禾草靈的測(cè)定，且高效氟吡甲禾靈的峰形不好，拖尾嚴(yán)重。謝勇波等[13]對(duì)煙葉的高效氟吡甲禾靈殘留進(jìn)行分析，用二氯甲烷-甲醇（5:1，v:v）作為洗脫液，可將高效氟吡甲禾靈與煙葉中雜質(zhì)有效分離，而我們用其作為洗脫液不能將土壤中的雜質(zhì)與3種目標(biāo)化合物有效分開(kāi)，這可能是由于土壤與煙葉中存在的雜質(zhì)極性不同造成的。當(dāng)把洗脫液中的甲醇換成極性比它弱的丙酮時(shí)，目標(biāo)物與雜質(zhì)分離較好，在用二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）洗脫時(shí)，3種目標(biāo)化合物的回收率為 77.5%～110.3%，無(wú)雜質(zhì)干擾測(cè)定，峰形良好。因此，選用二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）作為洗脫液。

2.3 HPLC條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 高效氟吡甲禾靈、精吡氟禾草靈和精喹禾靈甲醇溶液的紫外光譜表明，其最大吸收波長(zhǎng)分別為223、220、235 nm。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm時(shí)，高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈的靈敏度較高，精喹禾靈有雜質(zhì)峰干擾其測(cè)定；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm時(shí)，精喹禾靈的響應(yīng)值大，靈敏度高，但是高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈的靈敏度低，不能滿足檢測(cè)要求；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為223 nm時(shí)，盡管精喹禾靈的靈敏度度相對(duì)于在235 nm條件下稍有降低，但其峰形良好，高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈的靈敏度相對(duì)于在235 nm條件下均有大幅度提高，而且在此條件下雜質(zhì)干擾也較少。因此，選擇223 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 分離條件的優(yōu)化 在流速為 0.6 mL/min不變的條件下，分別考察了不同體積比（70:30、75:25、80:20、85:15）的甲醇和水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。當(dāng)柱溫為25 ℃，甲醇-水體積比為70:30時(shí)，在25 min內(nèi)未見(jiàn)3種供試農(nóng)藥出峰；當(dāng)甲醇-水體積比為85:15時(shí)，3種供試農(nóng)藥的保留時(shí)間變短，最遲出峰的農(nóng)藥精喹禾靈的保留時(shí)間為14.27 min,但是精吡氟禾草靈和精喹禾靈不能完全分開(kāi)，但當(dāng)柱溫升高至35 ℃時(shí)，不僅3個(gè)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值均增大，而且精吡氟禾草靈和精喹禾靈也能完全分開(kāi)。故選擇在柱溫為 35 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（85:15，v:v），流速為0.6 mL/min的條件下進(jìn)行測(cè)定。其典型色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系

準(zhǔn)確配制系列濃度為0.0050、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所優(yōu)選的條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積y與相應(yīng)的質(zhì)量濃度x(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程：高效氟吡甲禾靈為y=71.949x+ 4.8899（R2=0.9996），精吡氟禾草靈為y=59.757x+ 4.0504（R2=0.9979），精喹禾靈為y=111.08x+ 6.8451（R2=0.9974），表明3種目標(biāo)化合物在質(zhì)量濃度為0.005～5.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 方法的回收率、精密度

在植煙土壤和水中，分別添加了高效氟吡甲禾靈、精吡氟禾草靈及精喹禾靈的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)3個(gè)不同濃度水平，每個(gè)濃度水平樣品重復(fù)5次，按照前面優(yōu)選的方法處理及測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，3種供試除草劑在土壤中的添加回收率為77.5%～110.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～10.2%，在水中的添加回收率為 88.9%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.2%。此方法精密度和準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留量分析與檢測(cè)技術(shù)的要求。

圖1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品及其加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of pesticide standard solution, blank and spiked samples

表1 高效氟吡甲禾靈、精吡氟禾草靈和精喹禾靈在土壤和水中的添加回收試驗(yàn)Table 1 The spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of haloxyfop-p-methyl, fluazifop-p-butyl and quizafop-p-ethyl in soil and water

2.6 植煙環(huán)境中除草劑殘留分析

用所建立的方法可以對(duì)常用該類除草劑的土壤及周邊水體進(jìn)行分析檢測(cè)，以便得知這幾種除草劑在環(huán)境中的殘留情況。本實(shí)驗(yàn)對(duì)常用該類除草劑的湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草基地的植煙土壤及周邊的河水、池塘水及水渠進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一植煙土壤附近的水渠中存在精喹禾靈 0.016 mg/L殘留，其余植煙土壤和周邊水樣中均未檢測(cè)到。

3 結(jié) 論

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定植煙土壤及水樣中3種常見(jiàn)的芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑的分析方法。水樣使用二氯甲烷-丙酮（20:1，v:v）混合液提取，土壤樣品用丙酮提取，以弗羅里硅土凈化，二氯甲烷-丙酮（3:1，v:v）洗脫。該方法具有操作簡(jiǎn)單、分離效果好、回收率高、精密度高等特點(diǎn)，符合農(nóng)藥殘留分析要求，可用于植煙環(huán)境中土壤及水樣中3種常用芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑殘留量的同時(shí)測(cè)定。

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