體外微核試驗(yàn)重要影響因素研究

管 瑩，高 茜，朱洲海，米其利，李雪梅，繆明明，夭建華

（云南煙草科學(xué)研究院，云南 昆明650106）

微核試驗(yàn)檢測(cè)終點(diǎn)明確，且方法簡(jiǎn)便，易于開(kāi)展，是遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)之一。在食品、醫(yī)藥產(chǎn)品、工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品等與健康相關(guān)產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)、遺傳損害的監(jiān)測(cè)、特定人群的突變損傷檢測(cè)和早期預(yù)報(bào)等方面得到了廣泛的應(yīng)用［1－4］。近30年來(lái)，以減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）為核心的3R理論已愈來(lái)愈多地被國(guó)際社會(huì)所接受，利用體外微核試驗(yàn)對(duì)物質(zhì)的毒性進(jìn)行篩查，可有效地減少動(dòng)物的使用量，是當(dāng)今毒性測(cè)試發(fā)展的主要趨勢(shì)。體外微核試驗(yàn)多采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，為有核細(xì)胞，有核細(xì)胞微核的判定標(biāo)準(zhǔn)目前尚屬空白，對(duì)其的判定多借鑒《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》（以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)1）［1］和《新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐》（以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)2）［5］，這兩種判定標(biāo)準(zhǔn)均是基于骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)采用的是嗜多染紅細(xì)胞，無(wú)核，微核明顯，容易觀察和判定。故對(duì)有核細(xì)胞的微核判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入研究十分必要。

除此之外，體外微核試驗(yàn)采用離體培養(yǎng)的細(xì)胞，完全脫離了整體穩(wěn)態(tài)和內(nèi)分泌調(diào)控，其結(jié)果的穩(wěn)定性在很大程度上依賴于受試細(xì)胞本身，細(xì)胞自身的狀態(tài)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性具有重要影響。

因此，作者對(duì)已發(fā)現(xiàn)的影響微核試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素判定標(biāo)準(zhǔn)和細(xì)胞連續(xù)傳代代次進(jìn)行了深入研究，以期為提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外微核試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性及可比性提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑與儀器

DMEM／F12、LHC－8細(xì)胞培養(yǎng)基，Invitrogen公司；胎牛血清，GIBCO公司；PBS、胰蛋白酶、細(xì)胞松弛素B，Sigma公司；環(huán)磷酰胺；甲醇（分析純）；Giemsa染料；二甲基亞砜（DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）。

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning公司；超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma公司；離心機(jī)；顯微鏡；SM450型自動(dòng)吸煙機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

按常規(guī)方法消化CHO細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計(jì)為第1代細(xì)胞；待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時(shí)，按1∶4比例傳代，匯合率再次達(dá)到80%時(shí)計(jì)為第5代細(xì)胞；以此類推，連續(xù)傳代至第17代。

1.2.2 卷煙煙氣樣品的制備

按國(guó)標(biāo)方法［6］，利用自動(dòng)吸煙機(jī)抽吸20支標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試用卷煙3R4F，用直徑92mm的劍橋?yàn)V片捕集燃吸后產(chǎn)生的煙氣總粒相物（TPM），稱重并計(jì)算TPM的量；將劍橋?yàn)V片放入三角瓶中，加入適量DMSO，置于超聲儀上超聲20min；用無(wú)菌濾紙過(guò)濾，收集TPM提取液，調(diào)節(jié)TPM在DMSO中的終濃度為10mg·mL－1；將樣品分裝后于－80℃儲(chǔ)存待用。

1.2.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外微核試驗(yàn)

按常規(guī)方法消化CHO細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，將CHO細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)·mL－1，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2mL；將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h；每批試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、DMSO溶劑陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組、樣品組，其中樣品組分別設(shè)定1／2IC50、1／4 IC50、1／8IC50、1／16IC504個(gè)濃度（IC50值由中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定）；移除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，將配制好的空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和不同濃度TPM樣品溶液添加到培養(yǎng)板中，每孔2mL，同時(shí)加入細(xì)胞松弛素B溶液，終濃度為6μg·mL－1；將培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用胰蛋白酶溶液將細(xì)胞從培養(yǎng)板的表面消化下來(lái)；低滲后滴片；用新配制的Giemsa染液染色15min，自來(lái)水沖洗、風(fēng)干，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察1000個(gè)雙核細(xì)胞，計(jì)數(shù)微核的數(shù)量，計(jì)算微核率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS，選擇雙樣本t－test方法對(duì)不同處理試驗(yàn)組微核率之間是否有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)受試物微核率的影響

以CHO細(xì)胞為受試細(xì)胞，對(duì)參比卷煙3R4F的TPM在1／2IC50、1／4IC50、1／8IC50、1／16IC504個(gè)劑量下的微核率進(jìn)行檢測(cè)，分別參照標(biāo)準(zhǔn)1和標(biāo)準(zhǔn)2進(jìn)行顯微鏡鏡檢，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)誘發(fā)CHO細(xì)胞微核率計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.1 Micronucleus rate of CHO cells according to different scoring criteria

由圖1可知，隨著受試劑量的增大，受試物的平均微核率呈上升趨勢(shì)，依據(jù)兩種判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)同一受試物不同劑量下的微核率計(jì)數(shù)結(jié)果均有顯著差異（P＜0.05），但劑量－微核率總體趨勢(shì)較為一致。這主要是由于標(biāo)準(zhǔn)1和標(biāo)準(zhǔn)2對(duì)微核的相對(duì)大小判定有所差異，標(biāo)準(zhǔn)1規(guī)定微核直徑為細(xì)胞直徑的1／20～1／5［1］，標(biāo)準(zhǔn)2規(guī)定小者如針尖，大者可達(dá)細(xì)胞直徑的1／3～1／2［5］。標(biāo)準(zhǔn)2對(duì)微核大小判定范圍較標(biāo)準(zhǔn)1寬，以其為判定準(zhǔn)則對(duì)同一受試物誘發(fā)細(xì)胞微核率計(jì)數(shù)結(jié)果較高。由此可見(jiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)受試物誘發(fā)細(xì)胞微核率存在直接影響。此外，目前微核試驗(yàn)主要依靠人工顯微鏡鏡檢，微核判定還存在著主觀差異［7］。因此，統(tǒng)一微核判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)提高體外微核試驗(yàn)的可重復(fù)性及可比性是十分重要的。

由于兩種判定標(biāo)準(zhǔn)均是基于骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，屬于體內(nèi)微核試驗(yàn)，與本研究采用的CHO細(xì)胞體外微核試驗(yàn)在試驗(yàn)方法和細(xì)胞株的選擇上有所差異。通常體外微核試驗(yàn)采用細(xì)胞分裂阻滯微核（Cytokinesisblock micronucleus，CB－MN）分析技術(shù)，計(jì)數(shù)一次核分裂后雙核細(xì)胞中的微核數(shù)，提高了微核識(shí)別的準(zhǔn)確性。雖然CHO細(xì)胞為OECD哺乳動(dòng)物體外微核試驗(yàn)指導(dǎo)文件［8］中推薦使用的細(xì)胞株，但未對(duì)其微核大小有明確規(guī)定。研究人員應(yīng)根據(jù)受試物的特性選擇適用判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 細(xì)胞連續(xù)傳代代次對(duì)受試物微核率的影響

分別取第1、5、9、13、17代CHO細(xì)胞為受試細(xì)胞，對(duì)參比卷煙3R4F的TPM的平均微核率進(jìn)行檢測(cè)，參照標(biāo)準(zhǔn)1進(jìn)行微核率計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同代次CHO細(xì)胞體外微核率計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.2 In vitro micronucleus rate of different passages CHO cells

由圖2可知，隨著細(xì)胞代次的升高，受試物平均微核率呈上升趨勢(shì)，第1代、第5代、第9代3個(gè)試驗(yàn)組的微核率較為一致（P＞0.05），但與第13代和第17代2個(gè)試驗(yàn)組的微核率有顯著差異（P＜0.05）。這表明，連續(xù)傳代9代以內(nèi)的CHO細(xì)胞的微核率較為一致。

2.3 討論

細(xì)胞的狀態(tài)也是影響微核率的重要因素之一。有研究對(duì)多種癌細(xì)胞株與正常細(xì)胞株的微核率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞株微核率明顯高于正常細(xì)胞株［9］。正常細(xì)胞株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后可自然癌化［9］，以老化的細(xì)胞作為檢測(cè)細(xì)胞必然會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性率升高。

3 結(jié)論

由于判定標(biāo)準(zhǔn)選用的不同會(huì)導(dǎo)致體外微核試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)顯著差異，為了提高體外微核試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性以及可比性，研究人員應(yīng)根據(jù)受試物的特性選擇合適的判定標(biāo)準(zhǔn)；其次，應(yīng)保證用于體外微核試驗(yàn)的細(xì)胞狀態(tài)的穩(wěn)定，CHO細(xì)胞連續(xù)傳代代次控制在9代以內(nèi)為佳。

［1］GB 15193－2003，食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序［S］.

［2］GB 15670－1995，農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法［S］.

［3］YY／T 0127.12－2008，牙科學(xué) 口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2單元：試驗(yàn)方法 微核試驗(yàn)［S］.

［4］SN／T 2178－2008，危險(xiǎn)品哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞 微核試驗(yàn)方法［S］.

［5］袁博俊，王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997：102－108.

［6］GB／T 19609－2004，卷煙用常規(guī)分析用吸煙機(jī)測(cè)定總粒相物和焦油［S］.

［7］閆學(xué)昆，陳英，杜杰，等.CB微核法圖像自動(dòng)分析技術(shù)研究進(jìn)展［J］.輻射防護(hù)通訊，2008，28（5）：9－14.

［8］OECD Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline 487：In vitro mammalian cell micronucleus test（MNvit）［S］.

［9］唐劍云，王相智，何博，等.不同類型細(xì)胞株的微核出現(xiàn)率［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1983，（1）：80－83.