10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系抗寒鍛煉特性的研究

洪 偉 趙娟娟 林 晗 吳承禎*，3

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 桉樹(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.中國(guó)科學(xué)院 城市環(huán)境研究所，福建 廈門(mén) 361021；3.武夷學(xué)院，福建 武夷山 354300）

抗寒鍛煉即冷適應(yīng)（cold acclimation），是植物在低溫作用下，抗寒力提高的過(guò)程，實(shí)質(zhì)上是植物感受低溫信號(hào)、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和代謝的環(huán)境適應(yīng)過(guò)程。當(dāng)氣溫回暖時(shí)，由抗寒鍛煉獲得的抗寒力會(huì)重新喪失，這個(gè)過(guò)程稱為解除鍛煉或脫鍛煉（cold－dehardening）。植物抗寒鍛煉的分子機(jī)理可以概括為低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控，調(diào)控的水平分別為轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后，其中轉(zhuǎn)錄前調(diào)控包括對(duì)低溫等環(huán)境信號(hào)的感受和傳導(dǎo)[1]?？购憻捘苷T導(dǎo)植物抗凍基因的表達(dá)使植物的抗凍性增強(qiáng)，因此對(duì)抗凍性的研究離不開(kāi)對(duì)抗寒鍛煉的研究。不同品種或變種，其抗寒鍛煉誘導(dǎo)抗凍性的能力不同。不同桉樹(shù)樹(shù)種也具有不同的抗寒鍛煉能力，Dugald M.Paton[2]對(duì)桉樹(shù)的研究顯示，5種桉樹(shù)對(duì)0.5℃鍛煉溫度的反應(yīng)明顯不同。

電導(dǎo)法被普遍用于植物抗凍性的研究和抗寒品種的篩選[3]。電導(dǎo)法作為比較基因型間抗凍性差異的細(xì)胞生態(tài)學(xué)指標(biāo)是可行的[3～6]，國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于桉樹(shù)及其他植物的抗凍性研究都表明，電解質(zhì)滲透率作為細(xì)胞膜傷害程度的指標(biāo)，與凍害水平間具有很好的相關(guān)性；電解質(zhì)滲透率配合Logistic方程對(duì)桉樹(shù)的凍害發(fā)展過(guò)程作出凍害曲線，擬合出的LT50能很好的反映植物的凍害存活率[4]。Raymond等[5]對(duì) E.regnans一個(gè)全同胞家系用電導(dǎo)法識(shí)別出一個(gè)抗霜凍的非加性遺傳組分。Byrne M.等[6]用電導(dǎo)法測(cè)定亮果桉抗凍性，結(jié)合其他QTL分析方法，定位了抗霜凍的2個(gè)QTL位點(diǎn)。我國(guó)引種桉樹(shù)（eucalyptus）盡管有上百年的歷史，但不同桉樹(shù)無(wú)性系的抗寒鍛煉特性研究未見(jiàn)報(bào)道，尤其以冷庫(kù)為平臺(tái)探討抗寒鍛煉、脫鍛煉及苗齡處理對(duì)桉樹(shù)膜傷害影響國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系為對(duì)象，以大型冷庫(kù)為平臺(tái)，通過(guò)電導(dǎo)率評(píng)價(jià)抗寒鍛煉、脫鍛煉對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系的影響，對(duì)區(qū)別桉樹(shù)基礎(chǔ)抗凍能力與冷鍛煉能力、評(píng)價(jià)桉樹(shù)抗凍性具有重要理論價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系作為實(shí)驗(yàn)材料，依次編碼為XL1～XL10。實(shí)驗(yàn)材料為組培苗，每個(gè)無(wú)性系30株，經(jīng)2個(gè)月的培育，苗高及葉量達(dá)到要求后，于2005年9～10月進(jìn)行抗寒鍛煉、脫鍛煉及凍害脅迫處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 抗寒鍛煉與脫鍛煉處理法

每個(gè)無(wú)性系取生長(zhǎng)一致的幼苗各18株。其中CK0處理和CK對(duì)照各3株，培育于常溫下的苗圃中。其余植株作為處理株進(jìn)入冷庫(kù)進(jìn)行抗寒鍛煉與脫鍛煉的實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

整個(gè)處理過(guò)程以抗寒鍛煉情況為準(zhǔn)分為6種處理。處理1：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前常溫下正常生長(zhǎng)的植株，記為CK0處理；處理2：實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后的對(duì)照株（實(shí)驗(yàn)日期共 32.5d），記為 CK 對(duì)照；處理 3：6℃恒溫處理 10d后的處理株，記為 CH1（cold－h(huán)ardening）處理；處理 4：處理3的基礎(chǔ)上再經(jīng)3℃恒溫處理10d的處理株，記為CH2處理；處理5：處理4的基礎(chǔ)上再經(jīng)0℃恒溫處理10d的處理株，記為CH3處理；處理6：處理5的基礎(chǔ)上再經(jīng)脫鍛煉處理的處理株，記為DH（De－h(huán)ardening）處理。脫鍛煉處理為5℃～25℃逐漸升溫處理，即5℃、10℃、15℃、20℃、25℃依次各 12h的處理。

1.2.2 凍害脅迫處理方法

鍛煉和脫鍛煉后進(jìn)行凍害脅迫，凍害脅迫時(shí)間為當(dāng)天 8:00～16:00，實(shí)驗(yàn)株轉(zhuǎn)入冷庫(kù)后于 8:00、10:00、12:00、14:00 和 16:00 時(shí)分別將溫度調(diào)為－2℃、－4℃、－6℃、－8℃、關(guān)機(jī)；降溫速度為 5℃/min，每個(gè)溫度處停留2h，于16:00時(shí)脅迫處理完畢。每階段低溫脅迫處理結(jié)束后，分別對(duì)處理株采集葉片并測(cè)定電解質(zhì)滲透率。

以上鍛煉、脫鍛煉及凍害處理實(shí)驗(yàn)均在福建農(nóng)林大學(xué)福建省農(nóng)副產(chǎn)品保鮮技術(shù)工程中心自制的冷庫(kù)（共1～8號(hào)庫(kù)）內(nèi)進(jìn)行。該冷庫(kù)的實(shí)驗(yàn)條件為，光照時(shí)間每日8:00～17:00，光照強(qiáng)度150W/m2，光源為白熾燈；水分條件：土壤保持濕潤(rùn)，空氣濕度為80～100%。實(shí)驗(yàn)期間不進(jìn)行施肥或施藥處理。

1.3 半致死溫度的測(cè)定

1.3.1 電導(dǎo)率測(cè)定

零下低溫脅迫處理中，于當(dāng)天的8:00、10:00、12:00、14:00及16:00共5個(gè)整點(diǎn)時(shí)間分別對(duì)處理株順序采集+3～+7葉位的葉片，作為零下低溫脅迫各階段的處理樣品測(cè)定其電解質(zhì)滲透率的變化情況[3～6]。樣品經(jīng)充分沖洗后再經(jīng)單蒸水潤(rùn)洗，然后用1cm直徑的打孔器分別從每份樣品葉中隨機(jī)打取10個(gè)小圓葉片 （避開(kāi)葉脈及葉緣），放入10ml離心管中，加雙蒸水8ml，真空滲入3h，每隔1h取出離心管振蕩一次。待葉片下沉后，靜置10min，測(cè)定處理電導(dǎo)值B；后置沸水浴中10min，冷卻后測(cè)煮后電導(dǎo)值C。并依下式計(jì)算電解質(zhì)滲透率[3～6]：

1.3.2 半致死溫度計(jì)算

根據(jù)電解質(zhì)滲透率進(jìn)行回歸分析，得到logistic方程（y=k/(1+ea－rt)），求得 y=k/2 時(shí)的 t值（溫度）作為桉樹(shù)凍害脅迫的半致死溫度[3～6]。采用電解質(zhì)滲漏達(dá)到50%的低溫點(diǎn)作為植物的半致死溫度，即在“溫度－相對(duì)電導(dǎo)率”的S型曲線上表現(xiàn)為曲線的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度，以直觀、準(zhǔn)確地反映植物的抗寒能力[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析均采用Spss10.0與Excel 2000處理完成，Logistic曲線的擬合和拐點(diǎn)溫度的求解由自編的Qbasic程序計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗寒鍛煉處理半致死溫度的差異顯著性分析

分析測(cè)定10個(gè)無(wú)性系各6種處理的電解質(zhì)滲透率，獲得半致死溫度及曲線擬和R2值（表1）。對(duì)不同桉樹(shù)無(wú)性系半致死溫度進(jìn)行方差分析，表明6個(gè)處理間的差異性達(dá)到極顯著水平（p＜0.05），但是不同無(wú)性系間未達(dá)到顯著水平（p＞0.05）。表明，半致死溫度可用于比較6種不同處理的抗凍性差異，但不適于區(qū)別不同桉樹(shù)無(wú)性系間抗凍性的差異。盡管不同樹(shù)種間的抗凍性差異一般較明顯，但樹(shù)種不同無(wú)性系間的抗凍性差異比樹(shù)種間的差異小得多。

表1 10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系的半致死溫度（LT50，單位℃）Table 1 The temperatures for 50%survival rate of eucalypt clones(LT50，unit℃)

對(duì)10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系6個(gè)處理的半致死溫度進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)（表2），表明3種鍛煉處理中只有CH2鍛煉處理與CK對(duì)照處理的差異性達(dá)到極顯著水平，而CH1、CH3鍛煉處理與CK對(duì)照處理的差異均不顯著，即3個(gè)鍛煉處理水平中以CH2處理增強(qiáng)桉樹(shù)無(wú)性系抗凍性的效果最好。但DH脫鍛煉處理與CK對(duì)照處理的差異不顯著，因此CH2鍛煉處理所獲得的抗凍性經(jīng)脫鍛煉處理后將消失。3個(gè)鍛煉處理中，CH2與CH1、CH32個(gè)鍛煉處理之間的差異性均達(dá)到極顯著或顯著水平，但CH1、CH3之間的差異性不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明CH2抗寒鍛煉處理明顯比CH1、CH32種抗寒鍛煉處理更能提高桉樹(shù)的抗凍性。

2.2 抗寒鍛煉對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系抗凍性的影響

研究表明抗寒鍛煉可以增強(qiáng)大部分桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性，但是不同無(wú)性系對(duì)相同抗寒鍛煉處理的反映明顯不同（圖1），這與Dugald M.P.[2]的研究規(guī)律相一致。DH處理使大部分無(wú)性系的抗凍性重新降低，但是XL5和XL10的半致死溫度非但沒(méi)有上升反而下降，可見(jiàn)這2個(gè)無(wú)性系在0℃脅迫下抗凍性上升 （圖1），因此該脫鍛煉處理雖然使大部分無(wú)性系達(dá)到脫鍛煉的效果，但是還有部分無(wú)性系未脫鍛煉。

表2 不同低溫處理間半致死溫度的配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Paired-samples T test results of LT50 in different chilling treatments

總體而言，LT50反映的不同低溫處理對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性影響規(guī)律較為復(fù)雜，CH2鍛煉處理使大部分無(wú)性系的抗凍性大幅上升 （如 XL1、XL2、XL5、XL6、XL8、XL10），但也使一些無(wú)性系的抗凍性降低 （如XL4）。CH1和CH3鍛煉處理對(duì)大部分桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性沒(méi)有正面的影響，而是使其抗凍性大幅降低，或者不影響其抗凍性。苗齡相差1個(gè)月的苗齡處理，比苗齡更大的那組對(duì)照株抗凍性降低。

Li[8]將馬鈴薯抗凍基因型分為RA（冷抗可鍛煉型）、RUA （冷抗不可鍛煉型）、SA （冷敏可鍛煉型）、SUA（冷敏不可鍛煉型）4種類型，并推測(cè)植物的基礎(chǔ)抗凍性與鍛煉能力具有不同的遺傳機(jī)理。郭玉華等[9]的研究也支持此觀點(diǎn)，其用存活率和離子滲透率檢測(cè)法測(cè)定了18個(gè)小麥品種，結(jié)果表明，離子滲透率檢測(cè)分辨率最高的溫度是-10℃，抗寒性強(qiáng)的品種有不同的抗寒機(jī)制，基礎(chǔ)抗凍能力與冷鍛煉能力對(duì)最終抗凍性的貢獻(xiàn)有很大差別。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持相同的結(jié)論和推測(cè)。

2.3 桉樹(shù)無(wú)性系處理間半致死溫度差值的變化規(guī)律

將鍛煉、脫鍛煉、未鍛煉3種不同處理的半致死溫度相減，以比較處理間的差異（表3）。以所得差值作為不同處理桉樹(shù)無(wú)性系間抗凍性的差異水平，對(duì)不同處理間的抗凍性水平進(jìn)行比較分析。其中“CK-CK0”是常溫下正常生長(zhǎng)株在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1d（CK）與實(shí)驗(yàn)前1d（CK0）2個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的半致死溫度差值，代表常溫下正常生長(zhǎng)株經(jīng)過(guò)1個(gè)月的生長(zhǎng)之后半致死溫度的變化情況。由于CH2鍛煉處理、CH3鍛煉處理與DH脫鍛煉處理的處理時(shí)間分別為20d、30d和32.5d，所以其生長(zhǎng)引起的抗寒性與CK相似，選用CK對(duì)照與CH2、CH3和 DH 進(jìn)行比較，“CH2-CK ”、“CH3-CH2”和“DHCK”分別代表二者間的半致死溫度差值，是剔除生長(zhǎng)因素的影響后CH2、CH3鍛煉處理和DH脫鍛煉處理對(duì)桉樹(shù)半致死溫度的影響情況。同理，由于CH1鍛煉處理為10d，所以其生長(zhǎng)引起的抗寒性與CK0相似，借用與CK一樣未做低溫處理的CK0處理（苗齡處理）與CH1進(jìn)行比較。“CH1-CK0”即二者間的半致死溫度差值，代表剔除生長(zhǎng)因素的影響后CH1鍛煉處理對(duì)半致死溫度的影響情況。

由于10個(gè)無(wú)性系的對(duì)照株在實(shí)驗(yàn)期前、后的半致死溫度差值全部為負(fù)值，可知半致死溫度即抗凍性隨著苗齡的增加而上升（表3）。CH2鍛煉處理使無(wú)性系的抗凍性明顯增強(qiáng)，平均使各無(wú)性系的半致死溫度降低了4.95℃。CH1和CH3鍛煉處理可以增強(qiáng)某些無(wú)性系的抗凍性，但是效果不明顯。CH1鍛煉處理使無(wú)性系的半致死溫度平均下降了0.013℃，CH3處理使半致死溫度平均下降了0.128℃。進(jìn)一步證明，大部分無(wú)性系以CH2抗寒鍛煉處理（即6℃10d+3℃10d）增強(qiáng)抗凍性的效果最佳（表3）。

表3 不同鍛煉處理與對(duì)照處理的半致死溫度差值表Table 3 Deviation values between chilling treatment and CK

2.4 桉樹(shù)無(wú)性系抗寒鍛煉特性與抗凍性機(jī)理分析

根據(jù)郭玉華等[9]的方法，這里也將抗寒鍛煉前與抗寒鍛煉后桉樹(shù)無(wú)性系的半致死溫度進(jìn)行排序并分別聚為3類。應(yīng)用SPSS10.0對(duì)抗寒鍛煉前或未鍛煉（CK0）10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系的半致死溫度值（表 4），進(jìn)行K-均值聚類分析，其中1類的聚類中心為-4.37、2類的聚類中心為-2.31、3類的聚類中心為0.41（表4）。經(jīng)計(jì)算抗寒鍛煉處理后各無(wú)性系抗凍性的最大增強(qiáng)值即CH1-CK0、CH2-CK和CH3-CK中的最小值 （即LT50降低的最大值），可進(jìn)行增強(qiáng)值大小的排序和聚類分析（表4），其中1類的聚類中心為-8.54、2類的聚類中心為-4.96、3類的聚類中心為0.90。

基于冷抗與冷敏性，比較各無(wú)性系在鍛煉前的半致死溫度及抗寒鍛煉引起的抗凍性增加值 （表4）和CH3鍛煉引起的抗凍性增強(qiáng)值（表3），表明鍛煉前抗凍性聚類（CK0）為“1”的作為10個(gè)無(wú)性系中的冷抗無(wú)性系，聚類為“3”的作為冷敏無(wú)性系；鍛煉后ΔLT50聚類為“1”的是鍛煉性強(qiáng)的無(wú)性系，為“3”的是鍛煉性弱的無(wú)性系；聚類為“2”的均為中間型的無(wú)性系。

根據(jù)鍛煉后的maxΔLT50與鍛煉前的CK0對(duì)不同無(wú)性系的抗凍性機(jī)理進(jìn)行分析，XL4的CK0為“1”類，而其maxΔLT50為“3”類，所以XL4屬于冷抗不可鍛煉無(wú)性系；XL7的 CK0為“2”類，而其 maxΔLT50為“3”類，所以是中性抗冷不可鍛煉的無(wú)性系；XL5、XL8、XL9和XL10均為可鍛煉的無(wú)性系，maxΔLT50都為 “1”類，除XL10為冷敏可鍛煉無(wú)性系外其他無(wú)性系為中性抗凍可鍛煉無(wú)性系；其它4個(gè)無(wú)性系均為中等可鍛煉的無(wú)性系，其中XL1、XL3為中性抗凍中等可鍛煉無(wú)性系，而XL2和XL6為冷抗可鍛煉無(wú)性系。

表4 CK0處理桉樹(shù)無(wú)性系LT50與抗寒鍛煉后桉樹(shù)無(wú)性系maxΔLT50的聚類分析Table 4 Results of cluster analyses for the maxΔLT50 after chilling treatments functioning as cold-hardening processes and LT50 of SA treatment of eucalypt clones

3 結(jié)論與討論

研究10個(gè)桉樹(shù)無(wú)性系苗齡相差1個(gè)月的2種未鍛煉植株在凍害脅迫后半致死溫度的變化情況，發(fā)現(xiàn)所有無(wú)性系的抗凍性均在1個(gè)月后有所增強(qiáng)，半致死溫度平均降低了1.08℃，以苗齡更大的那組未鍛煉處理的抗凍性較高。而且不同的桉樹(shù)無(wú)性系根據(jù)半致死溫度進(jìn)行抗凍性排序的結(jié)果，在1個(gè)月的生長(zhǎng)期后有較大的變化?？梢?jiàn)桉樹(shù)不同無(wú)性系的抗凍性會(huì)隨著苗齡的增長(zhǎng)而變化，并且變化的幅度和抗凍性排序的結(jié)果都有變化。本實(shí)驗(yàn)選用苗齡相同的無(wú)性系進(jìn)行抗寒鍛煉性研究，并設(shè)置了1個(gè)苗齡處理比較生長(zhǎng)與抗寒鍛煉對(duì)抗凍性的影響，在抗寒鍛煉的分析過(guò)程中剔除生長(zhǎng)對(duì)抗凍性的影響進(jìn)行分析，使抗凍性評(píng)價(jià)和抗寒鍛煉性分析的準(zhǔn)確性大大提高。

半致死溫度計(jì)算結(jié)果表明，6個(gè)處理之間的差異性達(dá)到極顯著水平，但是不同無(wú)性系間半致死溫度的差異未達(dá)到顯著水平，所以半致死溫度用以比較不同處理的抗凍性差異是適宜的。不同低溫處理對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性影響規(guī)律較為復(fù)雜。大多數(shù)的桉樹(shù)無(wú)性系在6℃10d+3℃10d的CH2鍛煉處理后，抗凍性比未鍛煉的對(duì)照株有大幅度增強(qiáng)，半致死溫度平均降低了4.95℃；但是也有一些無(wú)性系的抗凍性降低。CH1和CH3鍛煉處理對(duì)大部分桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性沒(méi)有正面的影響，而是使其抗凍性大幅降低，或者不影響其抗凍性。脫鍛煉處理對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性恢復(fù)能力也有不同。根據(jù)鍛煉后的maxΔLT50與鍛煉前的CK0對(duì)桉樹(shù)不同無(wú)性系的抗凍性，借鑒Li[8]對(duì)抗凍性基因型劃分的4種類型，認(rèn)為XL4屬于冷抗不可鍛煉無(wú)性系、XL7屬冷敏不可鍛煉的無(wú)性系，XL2和XL6為冷抗可鍛煉無(wú)性系；其它6個(gè)無(wú)性系為冷敏可鍛煉無(wú)性系（ 其中 XL5、XL8、XL9屬中性抗凍可鍛煉無(wú)性系，XL10屬冷敏可鍛煉無(wú)性系，XL1、XL3屬中性抗凍中等可鍛煉無(wú)性系）。

植物抗凍性與其抗寒鍛煉性有很大的關(guān)系，這種抗寒鍛煉程度在自然界表現(xiàn)為零下低溫凍害前零上低溫的溫度和持續(xù)時(shí)間，因此不同地區(qū)不同氣候下形成的抗寒鍛煉條件是不同的。Dugald M.P.[2]研究表明，熱帶種棉芝老桉（Eucalyptus.deglupta）不能響應(yīng)低溫鍛煉，不管它鍛煉時(shí)間多長(zhǎng)，在-8℃冰凍下所有植株都死亡；而多枝桉 （Eucalyptus.viminalis）和稀花桉（Eucalyptus.Pouciflora）經(jīng) 4～5d鍛煉后有半數(shù)以上的植株足以忍耐-8℃冰凍并且無(wú)傷害，這2種桉樹(shù)的最大抗凍力分別產(chǎn)生于鍛煉后10d和20d，且稀花桉的抗性比多枝桉大得多；其余幾種桉樹(shù)的鍛煉啟始速率及最終達(dá)到的抗凍水平介于稀花桉和棉枝老桉之間。因此，樹(shù)種抗寒性鍛煉，其抗凍性差異較大，本研究也表明抗寒性處理不同桉樹(shù)抗凍性排序不一樣。同理，桉樹(shù)抗寒鍛煉受體生長(zhǎng)期不一樣，其抗凍性排序也將變化。因此桉樹(shù)抗寒無(wú)性系的篩選應(yīng)該選用什么實(shí)驗(yàn)材料、如何進(jìn)行抗寒性實(shí)驗(yàn)才能較好地反映成年桉樹(shù)無(wú)性系的抗凍性還有待進(jìn)一步探討。

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