泰安市2010～2012年手足口病不同標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果分析

張榮強(qiáng) 侯佩強(qiáng) 倪 楠 張愛(ài)華 楊會(huì)利

(泰安市疾病預(yù)防控制中心，山東 泰安 271000)

手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見(jiàn)傳染病。多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡[1-2]。2008年安徽爆發(fā)手足口病，該病引起全國(guó)關(guān)注，至今國(guó)內(nèi)已出現(xiàn)多次暴發(fā)或流行。但由于該病致病機(jī)制尚不清楚，目前沒(méi)有有效的預(yù)防和治療藥物及疫苗。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集對(duì)象的選擇和數(shù)量

標(biāo)本采集對(duì)象為疫情出現(xiàn)時(shí)手足口病的臨床診斷病例。用于進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本有糞便、咽拭子和血清，以及患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時(shí)醫(yī)院采集的腦脊液標(biāo)本。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過(guò)程中避免反復(fù)凍融，如果不能確保-20℃的條件，應(yīng)該在0～8℃運(yùn)輸和保存。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，不能立即進(jìn)行檢測(cè)的放置于-80℃冰柜中低溫保存。其中包括本地醫(yī)院臨床診斷為HFMD患者的糞便1356份、咽拭子標(biāo)本68份，血清98份，腦脊液156份。

1.2 標(biāo)本種類(lèi)及采集、運(yùn)送

糞便標(biāo)本：采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5～8 g/份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，4℃暫存或12 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-80℃冰箱。

咽拭子標(biāo)本：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專(zhuān)用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3 ml Hank’s保存液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。4℃暫存或12 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-80℃冰箱。

血清標(biāo)本：采集發(fā)病0～3 d的急性期病例血清用于抗體檢測(cè)。靜脈采集3～5 ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。

腦脊液標(biāo)本：對(duì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0～2.0 ml。采集后立即裝入無(wú)菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存或12 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-80℃冰箱。

1.3 主要試劑和儀器

核酸提取試劑(High pure Viral RNA kit，瑞士Roche公司),手足口病熒光定量檢測(cè)試劑(上海之江公司),熒光定量PCR儀(ABI7500型，美國(guó)AB公司)，低溫高速離心機(jī)3-18K(德國(guó)Sigma公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)。

1.4 標(biāo)本處理

在生物安全柜內(nèi)，取5 g左右的手足口病病例的糞便標(biāo)本，放入50 ml離心管，標(biāo)記標(biāo)本號(hào)，每管中加入10 ml PBS、1 g玻璃珠和1 ml氯仿；用振蕩器劇烈振蕩40 min；用冷凍離心機(jī)1500 g離心20 min；在生物安全柜中將每一份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)帶螺旋蓋的凍存管中；一管糞便懸液凍存于-70℃作為備份，另一管用于病毒檢測(cè)和病毒培養(yǎng)。

咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)或振蕩(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次(防止多次凍融)，使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 r/min離心20 min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過(guò)濾除菌。腦脊液標(biāo)本和血清標(biāo)本直接用于檢測(cè)和病毒分離。

1.5 RT-PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)

PCR反應(yīng)體系的配置：50 μl：無(wú)RNA酶水(Rnase Free Water)，28.8 μl；5×Buffer，10 μl；10 mM dNTP，2μl；Enzyme Mix，2 μl；Rnase inhibitor， 0.2 μl；上游引物，1 μl；下游引物，1 μl；RNA模板，5 μl。

反應(yīng)步驟：逆轉(zhuǎn)錄42℃，45 min；95℃，3 min；擴(kuò)增95℃，20 s，45℃，25 s ，72℃，30 s；32個(gè)循環(huán)，再延伸10 min。

結(jié)果分析：用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，并進(jìn)行核酸分析和電泳圖片保存。

1.6 Real time-PCR擴(kuò)增

熒光定量PCR法的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分類(lèi)數(shù)據(jù)采用頻數(shù)及百分?jǐn)?shù)表達(dá)。不同陽(yáng)性率之間的比較，采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同標(biāo)本之間檢測(cè)結(jié)果

2010～2012這三個(gè)檢測(cè)年度，對(duì)手足口病患者所采集的標(biāo)本有糞便標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本、腦脊液和血清四類(lèi)。在糞便標(biāo)本中，剔除肛拭子標(biāo)本和部分不合格標(biāo)本，選擇標(biāo)本為1356份。其中，糞便和咽拭子兩類(lèi)標(biāo)本核酸檢測(cè)的腸道病毒陽(yáng)性率分別為81.86%和39.70%，糞便標(biāo)本的腸道病毒陽(yáng)性率明顯高于咽拭子標(biāo)本，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2=27.05，P<0.01，兩類(lèi)標(biāo)本的陽(yáng)性率之間具有顯著性差異。雖然腦脊液標(biāo)本分離到病毒對(duì)手足口病的診斷有重要意義，但是其核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率卻非常低，只有7.69%，和糞便、咽拭子標(biāo)本的差異有顯著性。急性期的血清標(biāo)本采用ELISA檢測(cè)，雖然只能檢測(cè)EV71和CVA16，但陽(yáng)性率較高，為62.24%，和糞便標(biāo)本的EV71和CVA16兩個(gè)病原體之和的陽(yáng)性率62.83%(852/1356)比較，呈顯著性正相關(guān)(χ2=0.03，P<0.05)。不同標(biāo)本的陽(yáng)性率情況見(jiàn)表1。

表1 2010～2012年手足口病不同標(biāo)本的陽(yáng)性率[n(%)]

2.2 RT-PCR和Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.1手足口病的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 10份標(biāo)本的手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結(jié)果顯示，10份標(biāo)本均為陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為116 bp(圖1)。16份標(biāo)本的手足口病腸道病毒EV71特異性引物的RT-PCR結(jié)果顯示，2,3,4,6，9，10,16號(hào)標(biāo)本為陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為226 bp(圖2)。手足口病腸道病毒CVA16特異性引物的RT-PCR結(jié)果顯示，1,2,3,4,5,6,7,10號(hào)標(biāo)本為陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為208 bp(圖3)。

圖1 手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結(jié)果

圖2 手足口病腸道病毒EV71特異性引物RT-PCR結(jié)果

2.2.2手足口病的Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖4)

3 討 論

HFMD傳播快，流行性強(qiáng)，對(duì)5歲以下兒童危害尤其嚴(yán)重。HFMD屬自限性疾病，多表現(xiàn)為輕癥，但部分病例可發(fā)展為重癥，甚至危及生命[3]。引起HFMD的病原體主要為小RNA病毒科腸道病毒屬的柯薩奇A組的4、5、7、9、10、16型，B組的2、5、13型，部分埃可病毒和腸道病毒71型。其中以柯薩奇病毒A組的16型和腸道病毒71型最為常見(jiàn)[4]。

圖3 手足口病腸道病毒CVA16特異性引物RT-PCR結(jié)果

圖4 手足口病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果(ABI7500)

所采集的標(biāo)本主要有糞便標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本兩類(lèi)，兩類(lèi)標(biāo)本的腸道病毒的陽(yáng)性率分別為81.86%和39.70%，糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率明顯高于咽拭子標(biāo)本。另外，雖然腦脊液標(biāo)本分離到病毒對(duì)手足口病的診斷有重要意義，但是其核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率非常低，我們收集了本市婦幼保健院所采集的156份臨床腦脊液標(biāo)本，并對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，腸道病毒通用引物只有12份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為7.69%，和糞便、咽拭子標(biāo)本的差異有顯著性。急性期的血清標(biāo)本采用ElISA檢測(cè)，雖然只能檢測(cè)EV71和CVA16，但陽(yáng)性率較高，分別為28.57%和33.57%，和糞便標(biāo)本的這兩類(lèi)病原體檢測(cè)結(jié)果比較，呈顯著性正相關(guān)。對(duì)急癥期的手足口病入院兒童，開(kāi)展血清檢測(cè)EV71和CVA16的相關(guān)抗體，可以對(duì)HFMD起到初步診斷作用，這有利于對(duì)重癥病例病原的判斷。

本區(qū)域三個(gè)年度的1356例手足口病糞便標(biāo)本中，腸道病毒陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)為1110例，其中EV71和CVA16分別是348例和504例，主要病原體以EV71和CVA16為主，其中CVA16略高，另外尚有258例腸道病毒陽(yáng)性的標(biāo)本不是EV71和CVA16，而是其他病原體，由于還沒(méi)有特異性的檢測(cè)方法，因此無(wú)法了解這部分病例病原體的具體病毒型別。雖然近三年本區(qū)域CVA16的核酸檢測(cè)陽(yáng)性率高于EV71，但是無(wú)論在病毒的活躍程度上還是在病毒造成疾病的嚴(yán)重程度上，EV71都應(yīng)該更引起人們的重視[5]。下一步應(yīng)開(kāi)展更深入的監(jiān)測(cè)，獲取更多的病原學(xué)資料，進(jìn)一步開(kāi)展病毒的型別與變異監(jiān)測(cè)，更深入地了解病毒流行規(guī)律，對(duì)疫情早發(fā)現(xiàn)、早治療，減少其對(duì)人民健康的危害。

[1] 周世力,楊帆,金奇,等.腸道病毒71型的研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào),2003,19(3):284-286.

[2] 崔愛(ài)利,許文波,李秀珠.腸道病毒71型的RT-PCR診斷及基因特征[J].病毒學(xué)報(bào)， 2004, 20 (2):16-165.

[3] 牛文柯, 林藝, 丁淑軍, 等. 山東省EV71和CoxA16所致手足口病重癥病例流行病學(xué)及臨床特征分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2012,7(2):101-103.

[4] Robinson CR, Doanc FW, Rhodes AJ. Repor of an outbreak of febrile illness with pharyngeal and exanthen: totonto, 1957 Isolation of group A Coxsackie virus[J]. Canada Med Assoc J, 1958,79(3): 615-621.

[5] 鄭書(shū)發(fā),崔大偉,余斐,等.浙江省杭州地區(qū)手足口病病原譜分析和腸道病毒71 型VP1基因分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38(2):305-308.