尿NGAL在順鉑化療腫瘤患者腎小管損傷中的臨床意義探討

胡雷光，朱立岳，謝 芳，陳 堅，王昕蕾

(1.復旦大學附屬華山醫(yī)院靜安分院檢驗科，上海200040;2.復旦大學附屬華山醫(yī)院靜安分院腫瘤科，上海200040)

人類中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)最初被鑒定為一個相對分子質(zhì)量為25 000的蛋白，通過共價鍵連接于人中性白細胞明膠酶，且不易降解［1］。多年來，尿NGAL作為一個能反映急性腎損傷且可進行危險度分層的生物標志物越來越吸引國內(nèi)外醫(yī)學界同仁的興趣［2-7］。順鉑(DDP)是廣泛應用于治療多種腫瘤的有效的化療藥物，其作用有劑量依賴性，尤其是在腎臟中表現(xiàn)為高聚集、高排泄、高代謝，其腎毒性作用尤為突出［8］。動物研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型中通過順鉑誘導腎毒性損傷后，NGAL即可從腎小管細胞被快速誘導和分泌，不久可在尿中容易地被檢測到和定量［9］。因此，如何降低藥物性腎毒性，實現(xiàn)盡快診斷和干預，是目前臨床急需解決的課題。我們通過檢測DDP化療患者的尿NGAL等反映腎功能的微量蛋白指標，探討尿NGAL在判斷腎小管損傷中的臨床價值。

材料和方法

一、研究對象

選擇2011年6月至2012年6月復旦大學附屬華山醫(yī)院靜安分院腫瘤科住院的腫瘤患者58例，男25例，女33例，年齡55±7歲;罹患肺癌、乳腺癌、宮頸癌和腮腺癌等，均為經(jīng)手術或病理確診并接受順鉑(DDP)化療?；熐皺z查血肌酐值和尿常規(guī)均在生物參考區(qū)間內(nèi)，臨床上排除患有腎病史。58例患者中化療前共收集到57份尿液標本，根據(jù)患者是否初次入院接受化療分為已化療組(32例)和未化療組(25例);化療后共收集54份尿液標本，其中53份與化療前的標本相配對，余下1份為化療后收集到的標本。

隨機選取復旦大學附屬華山醫(yī)院靜安分院體檢中心體檢正常者51名作為正常對照組，男22名，女29名，年齡54±8歲，經(jīng)病史詢問、體格檢查以及血糖、肝腎功能和尿常規(guī)等檢查排除有腎病等疾病史。

二、檢測方法

1.儀器與試劑 雅培i1000全自動化學發(fā)光儀，NGAL試劑盒和質(zhì)控品均為原裝配套。日立7170s全自動生化分析儀。N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑和質(zhì)控品由浙江康特公司提供;α1-微球蛋白(α1-MG)、尿白蛋白(mAlb)及尿肌酐(UCr)試劑由關東化學公司提供，質(zhì)控品由羅氏公司提供。

2.方法 正常對照者在體檢時、腫瘤患者在化療前24 h和化療后24 h分別留取約20 mL隨機尿，1 000×g離心10 min后留取上清液放置2管潔凈的加蓋樣品管內(nèi)，其中1管于當日在日立7170s全自動生化分析儀上檢測 NAG、α1-MG、mAlb和Cr含量。另1管儲存于-70℃冰箱內(nèi)，集中檢測NGAL含量。2臺檢測儀器均使用相應的質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)量控制。

三、統(tǒng)計學方法

采用SAS8.02統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb測定結(jié)果以 UCr進行校正，即計算各項目與UCr的比值。各組比值數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗為非正態(tài)性分布，用中位數(shù)(M)［百分位(25% ～75%)］表示，使用均數(shù)間的多重比較的Levene’s檢驗，并進行方差統(tǒng)計分析，配對資料使用Wilcoxon符號秩和檢驗，異常檢出率使用χ2檢驗。以NAG/UCr陽性作為腎小管損傷的判斷指標，將全部觀察對象分為有損傷和無損傷2組，統(tǒng)計結(jié)果并繪制NGAL/UCr受試者工作特征(ROC)曲線。

結(jié) 果

一、化療前各組與正常對照組各項目檢測結(jié)果比較

除未化療組NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常對照組(P＜0.05)外，已化療組、未化療組和對照組之間其余項目差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

二、腫瘤患者DDP化療前、后的各項目檢測結(jié)果比較

化療前 NGAL/UCr、NAG/UCr、α1-MG/UCr與化療后比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而mAlb/UCr化療前、后差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

三、化療前、后 NGAL/UCr、NAG/UCr和 α1-MG/UCr異常檢出率比較

化療前 NGAL/UCr異常率與 NAG/UCr、α1-MG/UCr及3項指標聯(lián)合檢測的異常率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);化療后NGAL/UCr和3項指標聯(lián)合檢測的異常率明顯高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P ＜0.05)。見表3。

表1 化療前各組與正常對照組之間各項目檢測結(jié)果比較

表2 腫瘤患者DDP化療前、后各項目檢測結(jié)果比較

表3 化療前、后3項指標異常檢出率比較 ［例(%)］

四、NGAL/UCr的ROC曲線分析

將所有162例研究對象以NAG/UCr的陰、陽性結(jié)果與NGAL/UCr結(jié)果相對應，繪制出ROC曲線。ROC曲線下面積(AUC)=0.770 1［95%可信區(qū)間:0.698 4～0.841 7］，按 α=0.05檢驗水準，診斷試驗有判斷能力，診斷價值中等，診斷切割點在1.15 mg/mmol(靈敏度為82.09%、特異性為61.05%)。見圖1。

圖1 NGAL/UCr診斷腎小管損傷的ROC曲線

討 論

人類NGAL是一種小相對分子質(zhì)量分泌性蛋白，屬于lipocalin蛋白家族，近幾年愈來愈得到醫(yī)學界的興趣和關注。NGAL最初被鑒定為一個由178氨基酸殘段組成的單個多肽鏈，通過糖基化共價鍵與人中性白細胞明膠酶連接。分子克隆研究已提示人NGAL與誘導小鼠腎24p3基因產(chǎn)生的初級培養(yǎng)物相似，而X線晶體學實驗顯示在中性粒細胞和尿液中主要以單聚體、少許以二聚體或三聚體形式存在，隨后的實驗證明了NGAL是以一個復雜的共價鍵與相對分子質(zhì)量為92 000的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，明膠酶 B)相連接［1］。除此之外，NGAL主要與含鐵細胞表面膜受體(24p3R)以配位體形式連接并參與細胞內(nèi)鐵離子的轉(zhuǎn)運，在抗菌活力、炎性反應、胚胎形成和腫瘤生長中發(fā)揮重要的作用［10］。

NGAL在正常的人類組織包括腎、氣管、肺、胃和腸中表達水平較低，但損傷的上皮組織可明顯表達。cDNA芯片技術的研究發(fā)現(xiàn)在腎缺血損傷后的近曲小管上皮細胞中NGAL的表達顯著增強。NGAL可在腎小管發(fā)生損傷時作為一個鐵轉(zhuǎn)移性蛋白，全部或部分定位于腎近曲小管，誘導上皮細胞的繁殖和修復促進這些細胞存活，對腎臟起到保護作用［2］。雖然血漿中的NGAL可以自由通過腎小球，但絕大多數(shù)是在腎近曲小管通過有效mRNA依賴性的內(nèi)吞飲作用被重吸收。因此，尿液中出現(xiàn)NGAL僅可能是存在腎近曲小管損傷而妨礙其重吸收或體內(nèi)合成的大量增加［3］。另外關于基因?qū)W實驗報道，急性腎功能損傷時，在遠端腎單位，尤其是在Henle’s彎的粗升攀枝和集合管中，產(chǎn)生一個快速和大量NGAL mRNA的正調(diào)節(jié)作用，其過度表達的目的是產(chǎn)生抗菌功能的作用，但結(jié)果使其合成增加而直接分泌入尿液中［5-6］。綜合各項研究結(jié)果，NGAL能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復過程，可作為檢測早期腎小管損傷的生物學指標之一。

正常尿中有少量白蛋白存在，排泄量在0.03～0.3 mg/min的亞臨床范圍即mAlb。而α1-MG是一種相對分子質(zhì)量僅為26 000的糖蛋白，由167個氨基酸組成。血漿中游離α1-MG可自由通過腎小球，但99%被近曲小管重吸收，主要用于評估腎臟早期損傷時腎小管功能。而NAG是一種高分子糖蛋白，相對分子質(zhì)量較大，為140 000，也是體內(nèi)一種重要的溶菌體水解酶，在近曲小管上皮細胞中含量尤高。因不能通過腎小球基底膜，被認為屬于腎小管標志物。尿液中NAG明顯增多的原因是腎小管受損時，上皮細胞脫落、破壞，NAG釋放而產(chǎn)生［11-12］。因而尿NAG對于腎小管病變是一個已被公認的靈敏度和特異性較強的指標之一，可作為腎小管受損的早期診斷指標。

順鉑(DDP)是一種無機重金屬，廣泛應用于治療多種腫瘤的有效的化療藥物，其作用有劑量依賴性，但有腎毒性的風險，頻繁干擾著高劑量的使用所產(chǎn)生的抗腫瘤療效。而DDP的病理作用機理之一是引起近端腎小管上皮細胞缺血、缺氧，甚至壞死，其早期往往首先損害腎近曲小管，尤其是近曲小管直段細胞，導致腎小管細胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂［13-14］。對于順鉑治療而導致腎損傷如何采取早期發(fā)現(xiàn)和防治一直是眾多學者研究的熱點［9，13-15］。

本研究檢測了腫瘤術后化療患者和正常對照者尿NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb。結(jié)果顯示，未化療組NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常對照組(P＜0.05)。提示術后未化療的腫瘤患者相對于正常對照者已出現(xiàn)了輕度腎功能損傷，可能與手術或藥物對腎功能產(chǎn)生一定的影響有關，相對于α1-MG和 mAlb，NGAL、NAG或更顯敏感。已化療組與未化療組各項結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。產(chǎn)生的原因可能為順鉑化療效果雖然與其劑量成正相關，但是順鉑的早期輕度腎損害存在一定的可逆性，臨床上可以通過化療后使用消化道排毒和抗氧化劑的預防方法，降低藥物對腎臟的損傷從而起到保護作用［14］。但從化療前、后的對比分析來看，經(jīng)DDP一個療程化療后，尿中 NGAL、NAG和 α1-MG均明顯增高(P＜0.05)，而mAlb差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。這顯示腫瘤患者化療后盡管血Cr未出現(xiàn)異常，但已出現(xiàn)了輕度腎功能損傷，而DDP藥物毒性作用主要是對近端腎小管造成損傷而不是腎小球，與文獻［9，14-15］報道基本一致。分析各項指標的異常檢出率可以發(fā)現(xiàn)化療后NGAL/UCr和3項指標聯(lián)合檢測的異常率明顯高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P＜0.05)。說明NGAL的靈敏度高于其他2項指標，而三者聯(lián)合檢測更顯靈敏。從NGAL的ROC曲線分析，相對于公認的NAG判斷指標，對腎小管受損有早期診斷價值的最佳陽性判斷值為NGAL/UCr≥1.15 mg/mmol，此點的靈敏度為82.09%，特異性為61.05%。本研究認為要尋找臨床對早期腎小管受損的最佳診斷值，應將疑似患者做長期的追蹤研究直至尿常規(guī)、尿素和血Cr等腎功能指標出現(xiàn)陽性結(jié)果，其間能結(jié)合臨床癥狀和腎穿刺或手術等病理檢查的金標準將更加完善。此法有待于進一步地探討和研究。

Haase等［7］通過多中心的研究報道，雖然血清肌酐尚未出現(xiàn)臨床診斷性的改變，但尿中NGAL的增加可以判定患者的亞臨床診斷和不良的治療預后。隨著不斷深入的臨床診斷和治療的研究，對于腎功能輕微損傷的診斷手段也愈來愈多。尿NGAL/UCr對DDP化療患者的腎小管損傷和功能減退的檢出有一定的臨床價值。對于藥物性等腎毒性損傷，尿NGAL可以作為一種較為理想的生物標志物。

［1］須 靜，胡曉波.中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白的研究進展［J］.檢驗醫(yī)學，2012，27(10):871-876.

［2］Mishra J，Ma Q，Prada A，et al.Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14(10):2534-2543.

［3］Schmidt-Ott KM，Mori K，Li JY，et al.Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(2):407-413.

［4］蔡雷鳴，厲 倩，金才峰，等.血清中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白檢測在急性腎功能損傷早期診斷中的臨床意義［J］.檢驗醫(yī)學，2012，27(4):287-290.

［5］Ma Q，Devarajan P.Induction of proapoptotic Daxx following ischemic acute kidney injury［J］.Kidney Int，2008，74(3):310-318.

［6］Srichai MB，Hao C，Davis L，et al.Apoptosis of the thick ascending limb results in acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(8):1538-1546.

［7］Haase M，Devarajan P，Haase-Fielitz A，et al.The outcome of neutrophil gelatinase-associated lipocalinpositive subclinical acute kidney injury:a multicenter pooled analysis of prospective studies［J］.J Am Coll Cardiol，2011，57(17):1752-1761.

［8］Ramesh G，Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-alpha［J］.Kidney Int，2004，65(2):490-499.

［9］Mishra J，Mori K，Ma Q，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin:a novel early urinary biomarker for cisplatin nephrotoxicity［J］.Am J Nephrol，2004，23(3):307-315.

［10］Devireddy LR，Gazin C，Zhu X，et al.A cell-surface receptorforlipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake［J］.Cell，2005，123(7):1293-1305.

［11］ 托馬斯.臨床實驗診斷學［M］.上海:上海科技出版社，2004:357-375.

［12］梁永正，史 偉，劉雙信，等.腎小管功能檢測在IgA腎病中的意義［J］.廣東醫(yī)學，2004，25(2):185-186.

［13］Gonzales-Vitale JC，Hayes DM，Cvitkovic E，et al.The renal pathology in clinical trials of cis-platinum(Ⅱ)diamminedichloride［J］.Cancer，1997，39(4):1362-1371.

［14］曾 健，勞 山.順鉑腎毒性機制及其防護的研究進展［J］. 中國實用醫(yī)藥，2008，3(10):194-195.

［15］Gaspari F，Cravedi P，Mandalà M，et al.Predicting cisplatin-induced acutekidney injury by urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin excretion:a pilot prospective case-control study［J］.Nephron Clin Pract，2010，115(2):c154-c160.