65株臨床分離MRSA的SCCmec基因分型及耐藥性研究

王愛(ài)玲，紀(jì) 冰，孫萬(wàn)菊，孟 瑋，安新業(yè)，宿振國(guó)，王連文，張玉梅

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州256603;2.濱州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東煙臺(tái)264003)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA)是一種引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的多重耐藥菌。1961年在英國(guó)發(fā)現(xiàn)了世界首例MRSA，從此MRSA的感染遍布全世界，并成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌。由于其耐藥譜廣、耐藥強(qiáng)度高，給臨床治療帶來(lái)了很大困難，也因此受到廣泛關(guān)注和重視。了解MRSA的耐藥情況，并對(duì)當(dāng)前流行的MRSA臨床株進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地分型，對(duì)于臨床合理選用藥物、了解菌株來(lái)源以及制定MRSA感染的防控措施有重要意義。我們采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)分離的MRSA進(jìn)行基因分型及耐藥基因檢測(cè)，以了解MRSA的葡萄球菌盒染色體(SCCmec)基因型分布特征及耐藥狀況。

材料和方法

一、材料

1.菌株來(lái)源及鑒定 受檢菌株均分離自濱州市某三級(jí)甲等醫(yī)院各臨床標(biāo)本，共計(jì)115株;其中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)50 株，MRSA 65株。菌株鑒定采用先德自動(dòng)化微生物鑒定儀(英國(guó))鑒定，MRSA的篩選應(yīng)用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的頭孢西丁紙片擴(kuò)散法進(jìn)行篩選。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.主要試劑與儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、100 bp DNA Ladder Marker、PCR 試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，溶葡萄球菌酶購(gòu)自生工生物(上海)有限公司?？咕幬?青霉素、氯霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達(dá)福普汀、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、環(huán)丙沙星、克拉霉素、克林霉素、紅霉素、加替沙星、慶大霉素、利福平 、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢曲松、氨芐西林 、復(fù)方磺胺甲口惡唑購(gòu)自O(shè)XIOD公司(英國(guó))。水解酪蛋白胨(MH)瓊脂購(gòu)自杭州天和生物有限公司。

二、方法

1.金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.SCCmec的多重PCR擴(kuò)增分型 SCCmec復(fù)合擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參考Zhang等［1］的報(bào)道并做適當(dāng)改變，PCR總反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，65℃ 退火45 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán);再94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，以100 bp Ladder DNA Marker為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。SCCmec Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、V 型分別出現(xiàn) 613、398、280、776、493、200、881、325 bp 條帶，147 bp條帶為mecA基因內(nèi)部片段。SCCmec分型引物由上海英駿生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

3.藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定19種抗菌藥物的敏感性，分別以金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株。

4.耐藥基因的PCR擴(kuò)增 對(duì)分離的65株MRSA菌株進(jìn)行aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4種耐藥基因的PCR擴(kuò)增，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度參考有關(guān)文獻(xiàn)［2］，見(jiàn)表2。PCR總反應(yīng)體積為 25 μL，反應(yīng)條件為:93℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 SCCmec分型引物序列

表2 MRSA耐藥基因擴(kuò)增引物序列

結(jié) 果

一、SCCmec分型

所檢測(cè)的65株MRSA SCCmec的多重PCR擴(kuò)增分型結(jié)果均出現(xiàn)147 bp的mecA基因條帶，其中60株同時(shí)出現(xiàn)280 bp條帶，為SCCmecⅢ型的MRSA，4株出現(xiàn)776 bp的條帶，為SCCmecⅣa型的MRSA，1株未分型。見(jiàn)圖1。

二、4種耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

aac(6')/aph(2'')基因的陽(yáng)性率為93.85%，aph(3')-Ⅲ基因的陽(yáng)性率為52.31%，tetM基因的陽(yáng)性率為92.31%，ant(4')基因的陽(yáng)性率為9.23%。見(jiàn)圖2。

三、藥物敏感性試驗(yàn)

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株的各種抗菌藥物敏感性結(jié)果均在CLSI規(guī)定的范圍內(nèi)，65株MRSA對(duì)19種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 部分MRSA的SCCmec多重PCR分型圖譜

圖2 部分MRSA aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4種耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

表3 65株MRSA對(duì)19種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果

討 論

目前認(rèn)為MRSA耐藥機(jī)制是MSSA獲得了SCCmec元件，由SCCmec元件上mecA基因編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白(PBP2a)，其與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的親和力低，從而產(chǎn)生對(duì)抗菌藥物的耐藥。對(duì)SCCmec進(jìn)行分型的方法很多，DNA測(cè)序可以很好的詮釋SCCmec基因島的結(jié)構(gòu)，但因其操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且價(jià)格昂貴，不適于進(jìn)行臨床篩查及推廣應(yīng)用。多重PCR分型方法因其簡(jiǎn)單快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床大規(guī)模篩查SCCmec基因型別的重要工具。2002年，Oliveira等［3］首次報(bào)道了用多重PCR對(duì)SCCmec進(jìn)行分型，2007年對(duì)原方法進(jìn)行了改進(jìn)［4］。但該方法是根據(jù)同時(shí)擴(kuò)增出現(xiàn)的多條帶形成的譜型來(lái)判定不同的型別，對(duì)于沒(méi)經(jīng)驗(yàn)的研究者來(lái)說(shuō)結(jié)果解釋和判斷存在一定的困難。2005年Zhang等［1］開(kāi)創(chuàng)了一種新型的多重PCR(簡(jiǎn)稱(chēng)Zhang法)，是目前公開(kāi)發(fā)表的唯一的單片段多重PCR分型方法，因每個(gè)型別對(duì)應(yīng)1條特異條帶，使其對(duì)SCCmec型和亞型的檢測(cè)和分類(lèi)更加簡(jiǎn)便可行，結(jié)果更易判斷。

目前通過(guò)對(duì)SCCmec基因分型的結(jié)果研究還發(fā)現(xiàn)，MRSA來(lái)源背景不同，SCCmec基因分型結(jié)果也不相同。來(lái)自醫(yī)院感染的MRSA主要基因型別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型，很少為Ⅳ型，其耐藥特點(diǎn)是對(duì)多藥耐藥;而來(lái)自社區(qū)感染的MRSA菌株基因型別為Ⅳ型，耐藥特點(diǎn)是對(duì)非β-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗菌藥物敏感。不同類(lèi)型的SCCmec不僅分布于不同環(huán)境，而且在世界不同地區(qū)流行的MRSA菌株攜帶的SCCmec類(lèi)型也是不相同的。在亞洲除日本和韓國(guó)的MRSA株主要攜帶Ⅱ型SCCmec基因型外，其他國(guó)家大多數(shù)分離的MRSA株均攜帶Ⅲ型SCCmec［5］。我國(guó)的嚴(yán)雪萍、潘軍、邵冬華、張楠等［6-9］學(xué)者對(duì)各地區(qū)分離的MRSA SCCmec檢測(cè)表明，我國(guó)分離的MRSA攜帶的SCCmec基因型也以Ⅲ型為主，同時(shí)也有不同比例的其他型SCC-mec存在。本研究對(duì)所檢測(cè)的65株MRSA進(jìn)行SCCmec擴(kuò)增分型，結(jié)果表明60株為SCCmecⅢ型的MRSA，4株為SCCmecⅣa型的MRSA，說(shuō)明引起本地區(qū)感染的MRSA以SCCmecⅢ型為主，主要為醫(yī)院獲得性感染，和國(guó)內(nèi)報(bào)道一致。

藥物敏感性結(jié)果顯示65株MRSA全部為多重耐藥株，即對(duì)3種類(lèi)型以上的抗菌藥物耐藥。65株MRSA對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)全部耐藥，對(duì)慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、克林霉素耐藥率均＞90%，對(duì)氯霉素的耐藥率比較低，為4.62%。對(duì)這些菌株耐藥基因的檢測(cè)表明，本地區(qū)分離的攜帶SCCmecⅢ型MRSA的氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aac(6')/aph(2'')陽(yáng)性率為93.85%，四環(huán)素類(lèi)耐藥相關(guān)基因tetM的陽(yáng)性率為92.31%，有著非常高的陽(yáng)性率，與有關(guān)報(bào)道［10］相符，也符合醫(yī)院感染MRSA的耐藥基因攜帶特征。

MRSA已成為醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的主要病原菌，因其耐藥率高，由其引起的感染病死率較高，如監(jiān)測(cè)和控制不當(dāng)，將引起醫(yī)院或社區(qū)感染的爆發(fā)。因此了解各地MRSA的發(fā)生率、SCCmec分型特點(diǎn)，進(jìn)一步闡明MRSA耐藥分子機(jī)制及其基因分型，為積極開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物提供理論依據(jù)，從而切斷MRSA的傳染源和傳播途徑，預(yù)防其爆發(fā)流行。

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