耐亞胺培南銅綠假單胞菌金屬β－內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)及耐藥性分析

何力志，黃露萍，李志芳，彭愛(ài)紅

(湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜孔蛋白OprD缺失或表達(dá)下降、主動(dòng)外排泵系統(tǒng)表達(dá)增高等。目前，在PA中發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要是金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-betal-lactamase，MBL)。PA中編碼 MBL的基因大多由質(zhì)粒攜帶，且定位于整合子上。雖然目前報(bào)道產(chǎn)MBL的PA數(shù)量仍較少，但由于整合子的傳播特性使得 MBL的數(shù)量正在增加，隨時(shí)可能引起醫(yī)院感染的爆發(fā)和流行［1］。因此，加強(qiáng)對(duì)PA耐藥性的檢測(cè)和監(jiān)控，分析其藥物敏感性，指導(dǎo)臨床合理用藥，已成為防止耐藥產(chǎn)生與蔓延并進(jìn)行有效醫(yī)院感染控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本研究對(duì)湖南省第二人民醫(yī)院耐亞胺培南PA進(jìn)行了MBL的檢測(cè)及耐藥性分析。

材料和方法

一、材料

1.菌株的收集和鑒定 全部460株P(guān)A分離自湖南省第二人民醫(yī)院2009至2011年臨床標(biāo)本(排除同一患者同一部位的重復(fù)菌株)，其中痰液182株、咽拭子133株、創(chuàng)面分泌物69株、尿液60株、血液及引流液16株。標(biāo)準(zhǔn)菌株為PA(ATCC 27853)。

2.主要試劑與儀器 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物合成及試劑購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Microscan walkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)為美國(guó)德靈公司產(chǎn)品。水解酪蛋白胨(MH)瓊脂、亞胺培南等藥物敏感性紙片均為英國(guó)OXIOD公司產(chǎn)品。

二、方法

1.細(xì)菌鑒定與藥物敏感性試驗(yàn) 所有分離菌株的培養(yǎng)鑒定嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，采用德靈Microscan walkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)所有收集的菌株進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，藥物折點(diǎn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2009年標(biāo)準(zhǔn)。

2.組合紙片法檢測(cè)MBL表型 具體操作參照文獻(xiàn)［2］，直徑增大≥6 mm 為產(chǎn) MBL株［3］。

3.PCR檢測(cè)MBL基因型別 參照文獻(xiàn)［4-6］設(shè)計(jì)引物 IMP-1 、IMP-2、SPM-1、GIM-1，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增［7］，PCR鑒定后送生工生物上海有限公司測(cè)序，結(jié)果在GenBank網(wǎng)上比對(duì)。

4.耐藥性比較 比較2009至2011年不同年份耐亞胺培南PA產(chǎn)生比例，比較產(chǎn)與不產(chǎn)MBL耐亞胺培南PA耐藥譜差異，并對(duì)MBL不同基因型別菌株耐藥特征進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2009至2011年P(guān)A亞胺培南耐藥結(jié)果

460株P(guān)A中亞胺培南耐藥菌株173株，占37.6%。2009至2011年耐亞胺培南PA比例分別為35.0%(49/140)、37.3%(57/153)、40.2%(67/167)，有逐年增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

二、MBL表型

采用組合紙片法檢測(cè)MBL表型，173株耐亞胺培南PA中共檢出MBL表型陽(yáng)性PA 28株，占16.2%(28/173)。

三、MBL基因型別

28株MBL表型陽(yáng)性PA共擴(kuò)增IMP-1型陽(yáng)性19株，VIM-2型陽(yáng)性2株。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

四、測(cè)序結(jié)果

隨機(jī)各選取1例IMP-1和 VIM-2引物擴(kuò)增陽(yáng)性的菌株送生工生物(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果直接在GenBank中進(jìn)行序列對(duì)比分析，分別與 IMP-1 GenBank注冊(cè)號(hào)AY1686359和VIM-2 GenBank注冊(cè)號(hào)AF191564相同。

五、產(chǎn)與不產(chǎn)MBL耐亞胺培南PA耐藥譜的比較

173株耐亞胺培南PA，其中產(chǎn) MBL菌株21株，不產(chǎn)MBL菌株152株。產(chǎn)MBL菌株對(duì)美羅培南耐藥率為95.2%，高于不產(chǎn)MBL菌株(73.7%，P＜0.05);產(chǎn) MBL菌株對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均高于不產(chǎn)MBL菌株，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)MBL菌株與不產(chǎn)MBL菌株對(duì)不同藥物的耐藥率［株(%)］

六、MBL不同基因型別菌株的耐藥特征

產(chǎn)IMP-1型與VIM-2型MBL菌株引起耐藥的共同特點(diǎn)是能水解大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物:哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮-舒巴坦，對(duì)阿米卡星以外多種抗菌藥物耐藥。19株IMP-1型菌株中，3株對(duì)所測(cè)抗菌藥物全部耐藥，6株為同一耐藥模式，對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥，2株VIM-2型菌株全部對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥。

討 論

近年來(lái)，PA的臨床感染逐漸增多，其對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株亦有逐年上升的趨勢(shì)。王輝等［8］報(bào)道，2003至2004年中國(guó)10所教學(xué)醫(yī)院PA對(duì)亞胺培南的耐藥率為22% ～24%，2008年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，PA對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為30.5%、24.5%［9］。本研究臨床分離的PA對(duì)亞胺培南耐藥率從2009年的35.0%上升到2011年的40.2%。

產(chǎn)MBL是PA對(duì)亞胺培南耐藥的重要機(jī)制之一，其基因位于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上，可通過(guò)基因盒在不同細(xì)菌間水平傳播耐藥性。本研究173株耐亞胺培南 PA中產(chǎn) MBL菌株 21株，非產(chǎn)MBL菌株152株。比較產(chǎn)與不產(chǎn)MBL耐亞胺培南PA耐藥譜發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)MBL PA對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率要高于不產(chǎn)MBL PA，但除美羅培南外，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因可能是PA的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，往往不是由單一因素所造成，通常是幾種機(jī)制共同作用的結(jié)果。碳青霉烯酶是導(dǎo)致其對(duì)亞胺培南和美羅培南高水平耐藥［最低抑菌濃度(MIC)≥32 mg/L］的主要機(jī)制［10］。

本研究顯示，PA產(chǎn)MBL基因型別不同，耐藥性也不同。19株IMP-1型菌株中，3株對(duì)所測(cè)抗菌藥物全部耐藥，6株為同一耐藥模式，2株VIM-2型菌株全部對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥。IMP-1型和VIM-2型菌株，其耐藥模式存在一定程度差異，可能與該克隆株在不同感染個(gè)體所受到的抗菌藥物選擇壓力的差異有關(guān)，使其能自行啟動(dòng)某些耐藥機(jī)制以適應(yīng)其生存的環(huán)境。這提示，臨床上應(yīng)加強(qiáng)病原學(xué)檢查，根據(jù)藥物敏感性結(jié)果選擇藥物，以達(dá)到最佳抗菌效果。本研究IMP-1型菌株有6株為同一耐藥模式，是否為同一克隆株還需通過(guò)腸桿菌將基因間重復(fù)序列(ERIC)PCR電泳進(jìn)一步證實(shí)，但加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)酶株的檢測(cè)和監(jiān)控，對(duì)防止耐藥性的傳播和流行十分必要。

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