玉米活性肽制備最佳工藝條件研究

王乃強，李從從，楊海軍，王彩梅，王明珠

(1.保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200；2.山東省功能糖提取與應用技術重點實驗室，山東 禹城 251200）

玉米是世界上三大糧食作物之一，玉米深加工產業(yè)具有巨大市場潛力，每年有幾千萬噸玉米經過深加工生產淀粉、變性淀粉、淀粉糖、酒精、玉米胚芽油、味精等產品[1]。玉米蛋白粉是玉米深加工的重要副產物之一，由于其氣味獨特，色澤、水溶性差，目前大多作為畜禽飼料或者隨著廢水被排掉，并沒有得到很好的開發(fā)，既浪費了寶貴資源，又造成嚴重的環(huán)境污染[2]。我國玉米產量居世界第二位，每年產生大量的玉米蛋白粉，如能對其進行有效的加工利用，將大大提高玉米深加工行業(yè)的附加值。

玉米蛋白粉俗稱玉米黃粉，主要由玉米蛋白組成，蛋白質高達60%以上，還含有少量的淀粉、脂肪、纖維類胡蘿卜素。利用玉米黃粉可提取天然食用色素、玉米醇溶蛋白和谷氨酸等，還能制備具有多種生理功能的玉米活性肽，如谷氨酰胺肽、高F值低聚肽、降血壓肽和玉米蛋白肽等，從而大幅提升玉米的附加值[3]。

玉米活性肽是從玉米蛋白中酶解分離提取，根據分子量不同其活性也有所不同。其中由2—6個氨基酸組成，分子量集中在200～1 000的低聚肽混合物[4]，可以不經腸胃消化而被直接吸收[5]，從而使其在食品中的應用成為可能。新近研究發(fā)現[6-8]，玉米肽富含支鏈氨基酸，具有在肌肉中促進蛋白質合成和抑制蛋白質分解的作用，可以用于運動員食品和臨床營養(yǎng)品；玉米肽含有大量丙氨酸，可使身體吸收乙醇的速度減慢，并能促進酒精代謝，減少其毒性，可以大大減少飲酒引起的急性酒精中毒。另外，玉米肽具有降低血壓、降低血脂，輔助治療肝病和乳腺癌的生理活性作用。因此，開發(fā)玉米肽已成為玉米綜合利用研究的一個新的熱點。

筆者對制備玉米活性肽的工藝進行了研究，首先通過連續(xù)逆流超聲技術提取玉米蛋白粉中的醇溶蛋白，提取物進行水解并對各項工藝參數進行優(yōu)化，同時采用二級膜分離水解物，得到兩種純度較高的不同分子量玉米活性肽產品，提高了玉米資源的綜合利用率及附加值。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米蛋白粉（蛋白質含量60%，市售），蛋白酶 Alcalase(諾維信公司)，NaOH，HCl，甲醛，乙醇。

1.2 儀器

恒溫水浴鍋，分析天平，分光光度計，酸度計，溫度計，膜過濾裝置，連續(xù)逆流超聲提取裝置，萬用電爐等。

1.3 方法

1.3.1 氨基氮測定方法

采用甲醛滴定法，在參照GB/T 5009.39—2003的基礎上略有改動，操作如下：將水解液在5 000 r/min下離心10 min，取2 mL上清液于三角瓶中，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定到pH值8.2，加入4 mL 37%的甲醛溶液（提前用0.1 mol/L NaOH調到pH=8.2），再用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定到pH=9.2，記錄加入甲醛后把溶液滴定到pH=9.2所消耗堿量，空白對照用蒸餾水代替樣品，采用pH計測量pH值。

采用公式以下計算氨基氮：

式中：h——樣品中氨基酸含量；

V1——滴定樣品消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；

V0——滴定空白消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；

NNaOH——氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；

1.3.2 水解度的計算方法

采用以下公式計算水解度

水解度（DH）= （h1-h0）/htot

式中h1——測得水解液中氨基氮含量（mg/mL)

h0——測得玉米蛋白粉混懸液中氨基氮含量（mg/mL）；

htot——每毫升水解液中總氮含量（mg/mL）。

1.4 工藝流程

2 結果與討論

2.1 玉米蛋白粉的預處理

本研究首先對玉米蛋白粉進行粉碎，以有利于目的產物的提取和分離，然后采用連續(xù)逆流超聲提取技術提取玉醇溶蛋白的提取率。在玉米蛋白粉過40目篩，超聲波頻率40 kHz,溫度為40℃的條件下研究乙醇的濃度、乙醇-水溶液pH值、料液比和提取時間這四個因素對玉米醇溶蛋白提取率的影響進行正交試驗，確定最佳提取工藝條件，實驗設計如表1所示。

表1 玉米醇溶蛋白提取工藝因素水平表

正交試驗結果及分析如表2所示。

表2 正交設計結果統(tǒng)計分析

由正交試驗結果分析表明，極差R的大小決定因素影響的主次順序為：RA＞RB＞RD＞RC。此外由k值可知，最佳組合水平為A1B2C3D2，經實驗得知在此組合下玉米醇溶蛋白提取率為43.96%。因此，連續(xù)逆流超聲提取玉米醇溶蛋白的最佳工藝條件為：以pH8.0、濃度75%的乙醇作萃取液，玉米蛋白粉過40目篩，料液比1:6,在溫度40℃、超聲頻率40 kHz的條件下提取1 h，玉米醇溶蛋白的提取率達到43.9%。

2.2 蛋白酶水解玉米醇溶蛋白工藝條件的確定

以底物濃度、酶濃度、酶解時間三個可能影響水解度的因素做單因素優(yōu)化實驗，確定蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最優(yōu)工藝條件。

2.2.1 底物濃度對水解度的影響

在酶濃度3.0%、溫度50℃，pH8.5的條件下，水解1 h，選擇不同質量濃度3%,3.5%，4%,4.5%，5%,5.5%，6%的玉米醇溶蛋白，記錄不同底物濃度下水解度的變化，作底物濃度與水解度的關系曲線。

圖1 底物質量濃度對水解度的影響

由圖1可以看出，隨著底物濃度的增加，水解度逐漸上升，當底物質量濃度達到5%時，水解度最大；當底物質量濃度大于5%時，隨著底物質量濃度的增加，水解度反而降低，其原因可能是底物質量濃度增大后，蛋白不能充分與酶接觸，影響了酶對蛋白的作用，因此，酶解反應的底物濃度以5%為佳。

2.2.2 酶濃度對水解度的影響

在底物濃度5.0%、溫度50℃,pH8.5的條件下，水解1 h，選擇酶濃度1%,2%,3%,4%,5%，6%記錄不同酶濃度對水解度的變化，作出酶濃度與水解度的關系曲線。

圖2 酶濃度對水解度的影響

由圖2可以看出，酶濃度為3%時，水解度最大；隨著酶濃度的增加，水解度并非成正比例的增大。因此，僅增酶濃度來提高水解度效果不顯著。由此可以確定酶解反應的最適酶濃度為3%。

2.2.3 酶解時間對水解度的影響

在底物濃度5.0%,酶濃度3%,溫度50℃,pH8.5的條件下，選擇不同的酶解時間0.5 h,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h，3 h，3.5 h記錄不同酶解時間對水解度的變化，作酶解時間與水解度的關系曲線。

圖3 酶解時間對水解度的影響

由圖3可以看出，反應開始時，水解度隨著時間的延長而明顯升高；但1 h以后，水解度變化不是很明顯。由此可以確定最佳水解時間為1 h。

綜合以上實驗結果，在試驗中我們選用堿性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的條件為：玉米醇溶蛋白濃度調至5%，用0.1 mol/L的氫氧化鈉調至pH8.5，酶濃度3%，在50℃條件下保持1 h。反應過程中用1 mol/L氫氧化鈉調pH值，在此條件下醇溶蛋白水解度可達到41.82%。

2.3 精制

將酶解液滅酶離心分離，提取液用活性炭進行脫色，然后采用二級膜分離對沒解產物進行分離，首先采用截留分子量為10 000～30 000 Da超濾膜分離提純，然后采用納濾膜分離濃縮。最終得到兩種不同分子量范圍的玉米活性肽：濃縮液中玉米活性肽分子量在3 000～6 000 Da之間的達到80%以上，透過液中分子量在1000 Da以下的達到90%以上。再經離子交換、濃縮、干燥得到最終的玉米活性肽產品。

圖4 超濾與納濾后產品樣品分子量的分布

圖4為先后經過超濾和納濾后透過液中玉米活性肽的分子量分布圖。直接酶解后的產物分子量主要集中在在200～10 000 Da，這部分約占整個峰面積的90%以上，其中分子量在200～6 000 Da約占78%；分子量大于10 000 Da的約占8%，這部分應該是未被水解的蛋白質；分子量小于200 Da的約占2%。經超濾后有效地將分子量在10 000 Da以上的大分子量物質去除，酶解液的分子量均在10 000 Da以下。其中分子量在 2 000～6 000 Da約占 85%，200～2 000 Da的部分約占11%，分子量小于200 Da的約占4%。超濾后透過液再經進一步納濾，獲得兩種不同分子量的活性肽產品。其中透過液中分子量范圍在1 000 Da以內的活性肽含量占到90%以上，截留液中分子量范圍在3 000～6 000 Da的活性肽含量在88%以上，有效保證了活性肽產品的活性。

3 總 結

筆者對制備玉米活性肽的工藝分別從預處理、酶解、精制三個主要的方面進行了研究，得到了以下結論：

（1）確定了以玉米蛋白粉為原料制備玉米活性肽產品的工藝路線。

（2）利用連續(xù)逆流超聲提取設備提取玉米醇溶蛋白的最佳工藝條件：以pH8.0、濃度75%的乙醇作萃取液，玉米蛋白粉過40目篩，料液比1:6，在溫度40℃、超聲頻率40 kHz的條件下提取1 h，玉米醇溶蛋白的提取率達到43.96%。

（3）蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的最佳工藝條件為：將玉米醇溶蛋白濃度調至5%，用0.1 mol/L的氫氧化鈉調至pH8.5，酶濃度3%，在50℃條件下保持1 h，水解度可達到41.82%。反應過程中用1 mol/L氫氧化鈉調pH值。

（4）酶解后產品采用超濾、納濾分離，得到兩種分子量相對集中的活性肽產品，一種分子量范圍在3 000～6 000Da之間的玉米活性肽含量達到88%，另一種分子量范圍在1 000Da以下的玉米活性肽含量達到90%。

（5）首先得到較高提取率的玉米醇溶蛋白，酶解后生產出兩種不同分子量的玉米活性肽產品，實現了在同一生產工藝中生產兩個甚至多個高附加值產品，提高原料利用率，以創(chuàng)造更大的經濟效益、社會效益。

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