自體DC-CIK聯(lián)合膀胱內(nèi)吡柔比星灌注治療對淺表性膀胱癌術后復發(fā)和生存的影響

楊森，南存金，木海琦，王怡君，蘇紅俠，陳映鶴

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中70%為淺表性膀胱癌。手術是淺表性膀胱癌治療的主要手段，但是術后復發(fā)率高，嚴重影響了患者術后的生存率[1-2]。目前臨床廣泛采用吡柔比星等藥物行膀胱內(nèi)灌注化療，對預防淺表性膀胱癌術后復發(fā)具有一定的療效[3]。隨著細胞免疫治療在臨床上的開展，以樹突狀細胞（dendritic cells，DC）和細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）為主的免疫細胞治療被應用于預防原發(fā)性肝臟淋巴瘤和進展性腎癌術后復發(fā)，并取得了顯著的療效[4-5]。本研究將DC-CIK免疫細胞治療與吡柔比星膀胱內(nèi)灌注治療聯(lián)合用于預防膀胱癌術后復發(fā)，并探討了其對術后患者生存率等的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 我院于2009年6月到2012年6月共收治淺表性膀胱癌手術患者122例。入選標準：①患者術前均通過膀胱鏡檢查和病理學確診；②均為初發(fā)腫瘤患者；③所有患者術后治療均簽署知情同意書。122例患者按照術后治療方式分為對照組和觀察組，對照組53例，其中男28例，女25例；年齡26～80歲，平均（62.5±12.1）歲；腫瘤單發(fā)43例，多發(fā)10例；手術方法：經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術32例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤汽化術13例，接觸式激光膀胱腫瘤切除術 8例；術后病理分期：Ta25例，T119例，Tis9例。觀察組69例，其中男39例，女30例；年齡25～82歲，平均（63.1±12.6）歲；腫瘤單發(fā)62例，多發(fā)7例；手術方法：經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術46例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤汽化術12例，接觸式激光膀胱腫瘤切除術11例；術后病理分期：Ta34例，T121例，Tis14例。兩組患者年齡、性別、腫瘤數(shù)量、手術方式及術后病理分期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC-CIK細胞的體外擴增：采用血細胞分離機從患者外周血中分離單個核細胞，用淋巴細胞分離液進行純化后，細胞貼壁培養(yǎng)2 h。收集未貼壁的細胞，貼壁的細胞加入含GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/mL、TNF-α500 U/mL的PRMB 1640培養(yǎng)基，每4 d更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)8～12 d后即為DC。將上述未貼壁細胞濃度調(diào)整為2.5×106/mL，加入INF-γ1000 U/mL，第2天加入IL-1α100 U/mL、IL-2500 U/mL、CD3單抗50 ng/mL，每3 d更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)8～12 d后即為CIK細胞。將培養(yǎng)第9天的DC和CIK細胞按照1:5比例混合培養(yǎng)3 d，開始回輸。

細胞回輸質(zhì)控標準：培養(yǎng)第9天流式細胞術檢測CIK細胞CD3+CD56+≥50%，CD3+CD8+≥30%; DC CD80+、CD83+、CD86+、CD1α+、HLA-DR+細胞比例≥50%；細胞活力≥95%；不含細菌和內(nèi)毒素。

1.2.2 對照組治療方法：對照組給予膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療。方法如下：患者術后1周開始予吡柔比星（10 mg/支，深圳萬樂藥業(yè)有限公司）30 mg/次膀胱內(nèi)灌注，1周1次，共10次，此后每個月灌洗1次，連續(xù)灌洗10個月，總療程為12個月。

1.2.3 觀察組治療方法：患者術后先接受10周的膀胱內(nèi)灌注吡柔比星（即術后1周開始30 mg/次劑量行膀胱灌注，1周1次，共10次），然后靜脈輸注DC-CIK細胞5×109/次，連續(xù)輸注3 d，1次/d，3次為一個療程。此后膀胱內(nèi)灌注吡柔比星化療每月1次，在每2個月化療間隙給予患者一個療程的DCCIK免疫細胞治療，總療程為12個月，其中DC-CIK治療總計5個療程。

1.3 觀察指標及評定標準 分別對兩組術后累積復發(fā)率、累積生存率、不良反應及患者的免疫功能進行評定。免疫功能評定方法：分別在治療前后采集患者外周血，采用流式細胞術對患者外周血CD3、CD4、CD8陽性細胞的比例進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以 ±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組術后累積復發(fā)率和生存率比較 對照組術后1年和2年累積復發(fā)率分別為33.96%和73.58%，觀察組術后1年和2年累積復發(fā)率分別為18.18%和55.07%，如圖1A所示。對照組術后1年和2年累計生存率分別為33.96%和45.28%，觀察組術后1年和2年生存率分別為4.47%和26.09%，如圖1B所示。

2.2 兩組患者治療前后免疫功能分析 結果如表1所示，對照組和觀察組術后接受治療前外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組術后接受膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標較治療前有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。觀察組術后接受細胞免疫治療和膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療后CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標較治療前和對照組術后明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩組CD8治療前后差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 兩組不良反應比較 對照組24例出現(xiàn)不良反應，主要表現(xiàn)為尿急、尿頻和尿痛等；觀察組20例出現(xiàn)不良反應，以尿急、尿頻和尿痛為主。DC-CIK治療并未引起明顯不良反應。

圖1 兩組患者治療后累積復發(fā)率和生存率比較

表1 兩組術后治療前后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值變化

3 討論

膀胱癌近年來發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，位居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位。膀胱癌手術后腫瘤的復發(fā)率極高，且部分患者復發(fā)后出現(xiàn)腫瘤分期、分級提高，浸潤能力增強，給后期治療帶來了困難，也嚴重縮短了患者的生存時間。

吡柔比星是常用的膀胱內(nèi)灌注化療藥物之一，其屬于葸環(huán)類抗腫瘤抗生素，可進入腫瘤細胞抑制DNA合成，使腫瘤細胞增殖終止于G2期，最終使腫瘤細胞凋亡和壞死。吡柔比星在腫瘤細胞中擴散速度快，通過膀胱內(nèi)灌注可有效進入腫瘤細胞，消除原位腫瘤殘余病灶，達到預防術后復發(fā)的目的[6-7]。單純膀胱內(nèi)灌注吡柔比星預防淺表性膀胱癌術后復發(fā)雖有效果，但是術后復發(fā)率仍然較高。

DC-CIK細胞免疫療法是目前較為理想的過繼免疫治療方案[8]。DC是人體內(nèi)功能最強且是唯一能呈遞蛋白質(zhì)抗原的抗原遞呈細胞，可有效誘導機體抗腫瘤免疫反應[9]。CIK細胞具有與細胞毒T淋巴細胞相似的殺腫瘤細胞活性，其不受機體主要組織相容抗原（MHC）的限制，可以非特異性識別靶細胞，殺傷腫瘤細胞[10]。

本研究將吡柔比星膀胱內(nèi)灌注化療與DC-CIK細胞免疫療法相結合，分析了其對淺表性膀胱癌患者術后復發(fā)和生存情況的影響，結果顯示膀胱內(nèi)灌注吡柔比星與DC-CIK聯(lián)合治療患者術后復發(fā)率明顯下降，而生存率明顯升高，提示DC-CIK聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注吡柔比星對于淺表性膀胱癌術后復發(fā)有較好的療效。腫瘤患者存在機體免疫力低下和功能紊亂，表現(xiàn)為CD3+、CD4+陽性T淋巴細胞比例下調(diào)，CD4/CD8比值明顯下降[11]。本研究結果顯示，觀察組患者在接受DC-CIK細胞免疫治療后CD3+、CD4+陽性T淋巴細胞比例及CD4/CD8比值明顯增加，提示患者機體免疫功能提高，對殺傷殘留腫瘤細胞，降低術后復發(fā)率具有重要的意義。

綜上所示，DC-CIK聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注吡柔比星可顯著降低表淺性膀胱癌術后復發(fā)率，提高患者術后生存率，值得臨床推廣使用。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin, 2012 , 62(1): 10-29.

[2] Wang SY, Zhou CW, Chen P, et al. Laparoscopic radical cystectomy with orthotopic ileal neobladder in the treatment of invasive bladder cancer[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2012, 34(10): 793-796.

[3] 黃旭光, 潘曉明, 劉藝輝. 經(jīng)尿道膀胱電切術后吡柔比星灌注治療表淺性膀胱癌臨床分析[J]. 中國現(xiàn)代手術學雜志,2009, 13(2): 147-149.

[4] 脫帥, 張寧蘇, 張寧, 等. 樹突細胞聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞對原發(fā)性肝臟淋巴瘤生長和術后復發(fā)轉移的抑制作用[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010, 35(12): 1449-1454.

[5] Zhan HL, Gao X, Pu XY, et al. A randomized controlled trial of postoperative tumor lysate-pulsed dendritic cells and cytokine-induced killer cells immunotherapy in patients with localized and locally advanced renal cell carcinoma[J].Chin Med J (Engl), 2012, 125(21): 3771-3777.

[6] Arakawa M, Nakamura K, Yamada Y, et al. Intravesical administration of pirarubicin against superficial bladder cancer: Relationship between tumor tissue concentration and exposure time in the bladder or therapeutic effect[J].Exp Ther Med, 2011, 2(5): 901-905.

[7] Chen G, He Y, Wu X, et al. In vitro and in vivo studies of pirarubicin-loaded SWNT for the treatment of bladder cancer[J]. Braz J Med Biol Res, 2012, 45(8): 771-776.

[8] Shi SB, Ma TH, Li CH, et al. Effect of maintenance therapy with dendritic cells: cytokine-induced killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Tumori, 2012,98(3): 314-319.

[9] Zhong GC, Yan B, Sun Y, et al. Clinical efficacy of immunotherapy of dendritic cell and cytokine-induced killer cell combined with chemotherapy for treatment of multiple myeloma[J]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2012, 33(12):1000-1003.

[10] 袁潤強, 鄭少斌, 敖道暢, 等. CIK細胞回輸聯(lián)合沙培林膀胱灌注預防表淺膀胱癌術后復發(fā)[J]. 中華腔鏡泌尿外科雜志:電子版, 2009, 3(3): 214-217.

[11] 陳冬波, 張世強, 王保慶, 等. 樹突狀細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞免疫治療對惡性腫瘤化療后患者免疫功能的影響[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2011, 32(5): 571-575.