利用EROD和GST酶評(píng)估竹子制漿造紙廢水的生物毒性

侯麗萍 應(yīng)光國 舒 琥 趙建亮

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州，510006;2.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640;3.廣州大學(xué)華南生物多樣性研究所，廣東廣州，510006)

造紙廢水含有大量有毒的有機(jī)污染物，對(duì)造紙廢水進(jìn)行生物毒性測試可補(bǔ)充化學(xué)分析方法的不足，有效評(píng)價(jià)造紙廢水的安全性。目前，一般采用急性毒性測試方法［1］及基于細(xì)胞培養(yǎng)的生物標(biāo)記法來評(píng)估造紙廢水的綜合毒性［2］。

食蚊魚(Gambusia affinis)屬鳉形目(Cyprinodontiformes)、胎鳉科(Poeciliidae)，具有廣泛的生境適應(yīng)性、繁殖周期短、生殖率高、明顯的兩性性狀等特點(diǎn)，且易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，被廣泛用作造紙廢水毒性的指示生物物種［3］。采用酶活性指標(biāo)監(jiān)測造紙廢水污染程度尚處起步階段，且尚未有利用野生食蚊魚活體 7-乙氧基-3-異吩嗆哇酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufino-deethylase，EROD)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GST)來評(píng)估造紙廢水毒性的報(bào)道。EROD是混合功能氧化酶系統(tǒng)(MFO)的主要組分，屬細(xì)胞色素氧化酶p450系中同工酶CYP1A1的一族，為第一階段解毒酶，主要通過催化氧化反應(yīng)增加底物的極性。在正常水體環(huán)境中，魚體內(nèi)的EROD活性相對(duì)較低，但在某些特定的外來化學(xué)物質(zhì)(特別是各種多環(huán)芳香烴類化合物)的誘導(dǎo)下，魚體內(nèi)的EROD活性異常升高。因此，可將魚體內(nèi)EROD的活性作為水體環(huán)境中特定污染物的監(jiān)測指標(biāo)。GST廣泛存在于動(dòng)物肝臟微粒體中，是外源性物質(zhì)在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶類，也是內(nèi)源性物質(zhì)代謝的重要酶。GST屬于第二階段解毒酶，主要催化內(nèi)源性谷朧甘肽與底物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，從而提高底物的水溶性，有利于底物從生物體內(nèi)排出。

侯麗萍等［4］研究發(fā)現(xiàn)，廣東省四會(huì)市受竹子制漿造紙廢水污染的鄧村河道中食蚊魚的種群、個(gè)體和組織都發(fā)生了改變，并出現(xiàn)了雄性化的雌性食蚊魚，表明該區(qū)域河流可能受到竹子制漿造紙廢水中有毒有機(jī)物的污染，對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境和人們的健康造成嚴(yán)重的潛在影響。因此，本實(shí)驗(yàn)測定了鄧村河道中野生食蚊魚活體EROD和GST的活性，以研究竹子制漿造紙廢水對(duì)魚類生物轉(zhuǎn)化酶系的損害，并深入評(píng)估該區(qū)域造紙廢水的生物毒性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 造紙作坊與采樣點(diǎn)

調(diào)查區(qū)域?yàn)槭苤褡又茲{造紙廢水污染的廣東省四會(huì)市鄧村河(見圖1)。調(diào)查區(qū)域段的鄧村河沿岸有7家造紙作坊(造紙作坊M1與M2、M3與M4、M4與M5均相距約400 m，M2與M3、M5與M6、M6與M7分別相距約800、500、300 m)，均以竹子為原料，采用“小蘇打浸泡法”制漿，每個(gè)作坊的紙產(chǎn)品產(chǎn)量約為5 t/a。造紙廢水主要為碎竹和洗漿過程中產(chǎn)生的廢水，廢水只經(jīng)過濾處理后直接排入鄧村河，無其他處理措施，排放量約為40 m3/d。

圖1 采樣點(diǎn)與對(duì)照點(diǎn)示意圖

1.2 食蚊魚的采集及預(yù)處理

食蚊魚采集時(shí)間為2009年8月和2010年3月。在各采樣點(diǎn)，用大型漁網(wǎng)捕獲足夠數(shù)量的食蚊魚，放入已編號(hào)的大型塑料桶中，每個(gè)塑料桶盛裝10 L采樣點(diǎn)的原水，用氧氣泵充氧，并在24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，48 h內(nèi)進(jìn)行雌雄分類、解剖及性體指標(biāo)測定。EROD活性受魚體內(nèi)激素的影響較大，不同生長發(fā)育階段的雌性食蚊魚的EROD活性具有顯著差異。因此，在測定EROD活性時(shí)，把食蚊魚分為成熟雌性食蚊魚、未成熟雌性食蚊魚及成熟雄性食蚊魚，而測定GST活性時(shí)只分為雌性食蚊魚和雄性食蚊魚。根據(jù)Noggle［5］的方法，定義具有生殖突起的為雌性食蚊魚，無生殖突起的為雄性食蚊魚;交接器具有鉤狀結(jié)構(gòu)的雄性食蚊魚為成熟的雄性食蚊魚，不帶鉤狀結(jié)構(gòu)的為未成熟的雄性食蚊魚;體長＞20 mm的雌性食蚊魚為成熟的雌性食蚊魚，體長＜20 mm的雌性食蚊魚為未成熟的雌性食蚊魚;具有明顯胎斑的為懷孕的食蚊魚。分類后，挑選大小基本一致的食蚊魚進(jìn)行解剖，保證每個(gè)采樣點(diǎn)制備酶源的食蚊魚的數(shù)量不少于30條。采集食蚊魚的同時(shí)，測定各采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)，如pH值、溫度、硬度、溶氧量、TSS及BOD7。

1.3 酶源的制備

將食蚊魚于冰浴條件下解剖后，迅速取出魚肝組織，將用濾紙吸去血漬的魚肝置于組織勻漿器中。按以下步驟配置緩沖液 PBS1:加入11.184 g KCl和5.206 g HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)于1 L水中，調(diào)節(jié)pH值至7.5。加入1 mL該緩沖液于組織勻漿器中勻漿1 min。然后取適量勻漿液于高速冷凍離心機(jī)中(Beckman，4℃，10000 r/min)離心20 min。取上清液并分為3份，每份200 μL，在4℃下保存。其中，2份分別用于EROD和GST活性測定，1份用于酶源中蛋白質(zhì)含量的測定。

1.4 EROD活性的測定

采用改進(jìn)的快速終止熒光光度法測定食蚊魚的EROD活性，即根據(jù)鯽魚肝臟EROD活性的測定方法略作修改［6］。反應(yīng)體系包含190 μL磷酸緩沖液(濃度 0.1 mol/L，pH 值 7.8)，30 μL 7-乙氧基-3-異吩噁唑酮(ERF，濃度 1.73 μmol/L)，50 μL 酶源上清液。向測試管中加入30 μL四鈉鹽(NADPH，濃度0.4 mol/L)，并在 20℃水浴中反應(yīng) 10 min，加入2 mL預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)?？瞻坠苡弥卣羲婷冈瓷锨逡?。用熒光分光光度計(jì)測定產(chǎn)物7-羥基-3-異吩噁唑酮(RF)的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為585 nm。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到RF的含量，并計(jì)算EROD活性。

1.5 GST活性的測定

參照Habig等［7］的方法測定食蚊魚的GST活性。用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定，酶促反應(yīng)為1200 μL的反應(yīng)體系。向1.5 mL的離心管中加入150 μL的基質(zhì)液，50 μL酶源上清液，對(duì)照管不加酶液，在37℃下水浴10 min，再加入500 μL試劑(取試劑盒中的粉末加入170 mL 100℃的蒸餾水，充分溶解，取出試劑盒中50 mL的溶液，充分混合這兩種液體，即成過飽和溶液，該飽和溶液的上清液即為實(shí)驗(yàn)用的試劑)，500 μL無水乙醇，對(duì)照管另加入50 μL酶源上清液，大力振蕩搖勻后，在4000 r/min下常溫離心10 min，取上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)在1.5 mL的EPA管中進(jìn)行，反應(yīng)總體系為1125 μL。顯色反應(yīng)液混勻后在室溫下放置15 min，取300 μL顯色后的反應(yīng)液于96孔板中進(jìn)行412 nm吸光值的測試。

1.6 酶源中蛋白質(zhì)含量的測定

采用酶標(biāo)儀按Bradford的方法［8］測定酶源中蛋白質(zhì)的含量，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液為牛血清蛋白(BSA)。取適量離心后的酶源上清液或其稀釋液，加入顯色劑考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue G250)，當(dāng)顯色劑與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)色。測定前先按V(考馬斯亮藍(lán))∶V(水)=1∶4稀釋考馬斯亮藍(lán)，在96孔板中加入300 μL稀釋后的考馬斯亮藍(lán)，然后加入10 μL酶源上清液，并設(shè)3個(gè)孔加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，另外3個(gè)孔為空白樣。待反應(yīng)結(jié)束后，通過測定595 nm下的吸光度來確定酶源中蛋白質(zhì)的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS(ver.11.5)進(jìn)行分析;用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)不同采樣點(diǎn)食蚊魚的EROD和GST活性，并用Dunnett's test對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)后多重比較。如果P＜0.05，認(rèn)為有顯著性統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 各采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)

各采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)如表1所示。由表1可知，采樣點(diǎn)A、B、C處的水溫、pH值與對(duì)照點(diǎn)差異不大。與對(duì)照點(diǎn)的水質(zhì)相比，采樣點(diǎn)水質(zhì)的電導(dǎo)率稍高，溶氧量低，BOD7和TSS含量高。這表明，鄧村竹子制漿造紙廢水的排放對(duì)該區(qū)域水體環(huán)境造成了污染。

表1 采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)

2.2 造紙廢水對(duì)食蚊魚EROD活性的影響

圖2所示的是2009年夏季(8月)各個(gè)采樣點(diǎn)和對(duì)照點(diǎn)的食蚊魚EROD活性。由圖2可知，與對(duì)照點(diǎn)食蚊魚的EROD活性相比，各采樣點(diǎn)食蚊魚的EROD活性顯著高(P＜0.01)。對(duì)照點(diǎn)未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD 活 性 分 別 為 2.62 ×10-12、1.97 ×10-12、2.08×10-12mol/(min·mg)。其中，采樣點(diǎn) A處的未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的4.1、4.0和3.5倍;采樣點(diǎn)B處的未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的3.2、3.4、3.5倍;采樣點(diǎn)C處的未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的3.2、3.4、3.1倍。各采樣點(diǎn)的未成熟雌性食蚊魚的EROD活性比成熟雌性食蚊魚和成熟雄性食蚊魚的高。

圖2 2009年8月份鄧村造紙廢水對(duì)食蚊魚EROD活性的影響

圖3所示的是2010年春季(3月)各采樣點(diǎn)和對(duì)照點(diǎn)食蚊魚EROD活性。由圖3可知，對(duì)照點(diǎn)未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD 活 性 分 別 為 1.91 × 10-12、1.34 × 10-12、1.08×10-12mol/(min·mg)。與對(duì)照點(diǎn)相比，各采樣點(diǎn)食蚊魚的EROD活性顯著高(P＜0.01)。其中，采樣點(diǎn)A處的未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的4.6、4.4、2.2倍;B點(diǎn)未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的3.8、4.0、2.3倍;C點(diǎn)未成熟雌性食蚊魚、成熟雌性食蚊魚、成熟雄性食蚊魚的EROD活性分別為對(duì)照點(diǎn)的3.2、3.8、2.3倍。各采樣點(diǎn)的未成熟雌性食蚊魚的EROD活性比成熟雌性食蚊魚和成熟雄性食蚊魚高。

圖3 2010年3月份鄧村造紙廢水對(duì)食蚊魚EROD活性的影響

Andersson等［9］研究表明，與未受造紙廢水污染的河流中的魚類相比，生活在受含漂白工段造紙廢水污染的河流中魚類的EROD活性顯著升高，其活性與離造紙廠的距離成反比。目前，由于生產(chǎn)工藝的改良，漂白工段廢水中的許多對(duì)環(huán)境有害的化合物已被去除，如多氯聯(lián)苯(PCB)和多環(huán)芳烴(PAH)等。但Martel等［10］研究證實(shí)，不含漂白工段的造紙廢水仍會(huì)誘導(dǎo)魚類的EROD活性升高。他們認(rèn)為，造紙廢水中誘導(dǎo)魚類EROD活性升高的化合物不是高分子質(zhì)量的疏水性化合物，而是來源于造紙?jiān)牧现械亩?jí)PAH形式的疏水化合物——樹脂、緇醇類等物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，無論是夏季還是春季，生活于受鄧村竹子制漿造紙廢水污染的河道中的食蚊魚EROD活性均比對(duì)照點(diǎn)的高，說明該造紙廢水中的某些化合物能與細(xì)胞內(nèi)芳烴受體(Ah2R)結(jié)合，誘導(dǎo)了EROD活性升高。鄧村造紙作坊采用的原料是竹子，因此，很有可能在生產(chǎn)過程中釋放出來的緇醇類物質(zhì)在影響魚類生長發(fā)育的同時(shí)，誘發(fā)EROD活性升高，引發(fā)毒性效應(yīng)。因此，除了對(duì)常規(guī)的PCB和PAH化合物進(jìn)行監(jiān)測外，由二級(jí)PAH形式的疏水化合物引起的環(huán)境污染問題也需引起一定的重視。

Elskus等［11］研究表明，雌魚在繁殖期間生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)受到抑制，EROD活性也受到抑制。因此，處于繁殖期間的雌魚的EROD活性比其他魚的低。Bankey等［12］研究表明，造紙廢水均能引起未成熟和成熟黑鱸的EROD活性升高，未成熟黑鱸的EROD活性均比成熟并處于繁殖期間黑鱸的EROD活性高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，各采樣點(diǎn)未成熟雌性食蚊魚EROD活性比其他發(fā)育階段食蚊魚的EROD活性高，這與Bankey等的研究結(jié)果一致。

EROD在內(nèi)分泌系統(tǒng)中扮演何種角色及其對(duì)繁殖造成何種潛在的影響，機(jī)理如何，這些都需要進(jìn)一步研究。EROD的活性與水體環(huán)境的溫度、魚的種類、性別、生長發(fā)育階以及肝臟的健康情況密切相關(guān)，用其作為生物標(biāo)志物的時(shí)候一定要注意以上條件的差異性。

2.3 造紙廢水對(duì)食蚊魚GST活性的影響

圖4顯示的是2009年夏季(8月)鄧村竹子制漿造紙廢水對(duì)食蚊魚GST活性的影響。由圖4可知，與對(duì)照組雌性食蚊魚的GST活性相比，采樣點(diǎn)A、B處雌性食蚊魚的GST活性顯著降低(P＜0.05)。除了采樣點(diǎn)A外，采樣點(diǎn)B、C處的雄性食蚊魚的GST活性均比對(duì)照點(diǎn)的低，但無顯著差異(P＞0.05)。

圖5顯示的是2010年春季(3月)鄧村竹子制漿造紙廢水對(duì)食蚊魚GST活性的影響。由圖5可知，與對(duì)照點(diǎn)食蚊魚GST活性相比，采樣點(diǎn)A、B、C處食蚊魚的GST活性總體低，采樣點(diǎn)B處的雌性食蚊魚及C處的雌、雄食蚊魚的GST活性較對(duì)照點(diǎn)的有顯著差異(P＜0.05)。

GST是生物機(jī)體內(nèi)重要的代謝酶系之一。該酶存在于生物機(jī)體的各種組織中，具有消除體內(nèi)自由基和解毒的雙重功能，其活性的大小可反映生物機(jī)體抗氧化能力的高低，并對(duì)生物機(jī)體肝臟的早期損傷診斷具有一定的價(jià)值［13］。尹大強(qiáng)［14］研究證實(shí)，含漂白工段的造紙廢水會(huì)顯著誘導(dǎo)鯽魚肝臟微粒體GST的活性。Holth T F等［15］用造紙廢水暴露斑馬魚，研究結(jié)果表明，短時(shí)間暴露對(duì)斑馬魚GST活性起誘導(dǎo)作用，長時(shí)間暴露則起抑制作用。王重剛［16］的研究也發(fā)現(xiàn)，用2，4-二氯苯酚、苯并芘(BaP)、重金屬等污染物暴露魚類后，在短時(shí)間和低濃度劑量暴露時(shí)，其肝臟和脾臟的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和GST活性顯著升高;在長時(shí)間和高濃度劑量暴露后，由于魚體內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量降低和過氧化氫酶(CAT)活性增大，則污染物對(duì)GPx和GST活性的誘導(dǎo)作用消失，甚至抑制它們的活性。本研究結(jié)果顯示，各采樣點(diǎn)食蚊魚的GST活性總體比對(duì)照點(diǎn)的低，但只有個(gè)別采樣點(diǎn)出現(xiàn)顯著差異。GST活性低的原因可能是，受竹子制漿造紙廢水的污染程度比較嚴(yán)重，食蚊魚體內(nèi)GSH消耗過大，造成GST活性下降。以上結(jié)果表明，GST用作生物標(biāo)志物指示竹子制漿造紙廢水生物毒性時(shí)沒有EROD敏感。

3 結(jié)論

測定了生活于受竹子制漿造紙廢水(采用“小蘇打浸泡法”制漿)污染的河道中食蚊魚活體肝臟7-乙氧基-3-異吩嗆哇酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufinodeethylase，EROD)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GST)的活性。結(jié)果表明，食蚊魚可作為檢測竹子制漿造紙廢水污染的敏感生物標(biāo)志物，其EROD活性可有效真實(shí)地評(píng)價(jià)竹子制漿造紙廢水的安全性，GST在用作竹子制漿造紙廢水生物毒性的標(biāo)志物時(shí)，響應(yīng)沒有EROD敏感。EROD的活性與水溫、魚的性別、成熟階段及肝臟的健康情況密切相關(guān)，用其作為生物標(biāo)志物的時(shí)候一定要注意以上條件的差異性。

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