含雄黃的中成藥中砷的生物可給性及其初步風(fēng)險評價

褚卓棟，柳曉娟，趙全利，薛培英，劉文菊，*

1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，保定071000

2.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廊坊065000

3.中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準與風(fēng)險評估國家重點實驗室，北京100012

中成藥因服用方便、毒副作用小等特點及其標本兼治的藥效廣受人們的青睞，并逐漸被國際社會所接受[1]。中成藥的配方組成大致包括動物、植物及礦物3 大類藥材，其中對礦物藥材尤其是雄黃、朱砂等含重金屬礦物藥的應(yīng)用由來以久。對雄黃而言，正式列入現(xiàn)行四大中藥國家標準的含雄黃的成方制劑達193 種，約占所收載全部成方制劑的2.78%[2]。雄黃的主要成分為硫化砷(As4S4)，而砷是一種著名的有毒類金屬，且為世界公認的致癌物。添加雄黃成分會使中成藥中砷元素含量增加，此類中成藥的安全性會不可避免地遭到質(zhì)疑，類似的擔(dān)憂將嚴重阻礙中成藥的現(xiàn)代化和國際化[3-4]。然而人體消化系統(tǒng)不可能100%吸收存在于結(jié)合物中的污染物[5]，與重金屬總量相比，以其生物有效性為依據(jù)能夠更準確地評價含礦物藥的中成藥中重金屬的人體健康風(fēng)險。生物有效性(bioavailability)是指被人體吸收后進入血液，然后在體內(nèi)重新分布的污染物含量[6]。

生物有效性可以通過活體實驗(in vivo)測定，結(jié)果較為準確可靠，但具有實驗周期長、動物個體間存在差異等不足之處[7]。而體外實驗(in vitro)能夠在一定程度上評價生物體對物質(zhì)的吸收狀況。體外實驗方法以人工模擬胃腸法為主，通過加入胃腸中的各種主要酶和有機酸，模擬胃腸蠕動，且實驗系統(tǒng)處于37℃的厭氧環(huán)境，構(gòu)建了與真實腸胃更為相似的消化和吸收環(huán)境。在模擬的人工腸胃系統(tǒng)中，將可能被血液系統(tǒng)吸收的污染物的含量定義為污染物的生物可給性(bioaccessibility)[6]，是污染物被生物可能吸收的最大值。體外實驗方法由于操作方法簡單、實驗周期短、實驗條件易于控制，同時能夠很好地擬合活體實驗方法的實驗結(jié)果，近年來被廣泛應(yīng)用于食品、土壤中重金屬的健康風(fēng)險評價[6,8-11]。

以添加礦物藥材雄黃的中成藥物為研究對象，利用人工腸胃系統(tǒng)分析其生物可給性，并就其對人體健康風(fēng)險進行初步評價，以期為中藥安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品的采集與制備

中成藥樣品購自河北省保定市內(nèi)各大中藥店。含雄黃的中成藥共計14 種(含不同廠家生產(chǎn)的同種中成藥)。樣品片劑用陶瓷研缽研成粉末，水蜜丸按照一般服用習(xí)慣每丸分成16 個小丸，均按四分法取樣，其中一份用于重金屬全量測定，另一份用于人工腸胃實驗。

1.2 藥品及試劑

硝酸、鹽酸和過氧化氫(30%)均為優(yōu)級純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。砷標準儲備液采用國家標準物質(zhì)，購自天津百奧捷科技開發(fā)有限公司。人工腸胃實驗材料包括胃蛋白酶(產(chǎn)品號P7000)、胰酶(產(chǎn)品號P1500)和膽鹽(產(chǎn)品號B8631)，均為美國Sigma 公司產(chǎn)品。有機酸包括檸檬酸、蘋果酸、乳酸和冰醋酸，均為分析純，購自天津市化學(xué)試劑一廠。實驗用水均采用由Milli-Q 純水儀制備的去離子水(電阻率18.2 MΩ)。

1.3 主要儀器

Optima 2000DV 型ICP-OES(美國Perkin Elmer 公司)，AFS-3100 型雙道原子熒光光度計(北京科創(chuàng)海光儀器有限公司)，ZRS-8G 型智能藥物溶出儀(天津大學(xué)無線電廠生產(chǎn))，Milli-Q 純水儀(美國Millipore 公司)。

1.4 樣品砷全量分析方法

(1)消解處理

準確稱取中成藥0.5 g(精確至0.0001 g)，加入硝酸6 mL、過氧化氫3 mL，用壓力罐密閉消解4 h，冷卻至室溫后取出，轉(zhuǎn)移入50 mL 容量瓶中，用去離子水定容后，即為消解原液?？瞻缀蜆藴蕵悠凡捎猛瑯拥牟僮鞣椒ā?/p>

(2)砷含量的測定

吸取原液5 mL 于50 mL 玻璃比色管中，加入0.25 mL硝酸，定容后用ICP-OES(Optima 2000DV，美國)測定，同時做標準曲線及空白。

1.5 樣品砷生物可給性分析方法

采用經(jīng)改造的符合中國藥典要求的智能藥物溶出儀為主要組成部件，建立了由氬氣供應(yīng)系統(tǒng)、氣體流量計、藥物溶出儀(包括6 個反應(yīng)器、水浴槽和攪拌器)及pH 計組成的，基于生理學(xué)的體外實驗(in vitro)系統(tǒng)。參考了Ruby 等[6]和Rodriguez 等[8-11]的實驗方法，并進行了改進，具體實驗步驟如下。

(1)胃階段

每批次分析2 個樣品，每個樣品3 次重復(fù)。分析時先配制模擬胃液4 L，內(nèi)含0.15 mmol·L-1NaCl，加入檸檬酸2 g、蘋果酸2 g、乳酸1.68 mL、醋酸2 mL 和胃蛋白酶5 g，用12 mol·L-1HCl 將pH值調(diào)到1.5。然后，在6 個反應(yīng)器中加入600 mL 模擬胃液。在各反應(yīng)器中加入待測中成藥樣品(按照實際服用量加入)，在反應(yīng)液中通入氬氣，流量為1 L·min-1，以構(gòu)建厭氧環(huán)境，100 r·min-1下攪動1 h。1 h 后用針筒吸取10 mL 反應(yīng)液，在10 000 r·min-1下離心，以0.45 μm 濾膜過濾后，采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法分析濾液中的砷含量。

(2)小腸階段

用NaHCO3飽和溶液將反應(yīng)液pH 值調(diào)至8，在每個反應(yīng)器中加入胰酶0.36 g，膽鹽1.2 g，以1 L·min-1的流量通入氬氣，100 r·min-1下攪動4 h。每隔15 min，測定反應(yīng)液pH 值，若升高，滴加12維持pH 值為8。在小腸階段開始后4 h時吸取20 mL 反應(yīng)液，分析其中砷的含量。

在胃階段或小腸階段的生物可給性由下式計算:

式中，BA 為胃階段或小腸階段的生物可給性(%);CIV是體外實驗的胃階段或腸階段反應(yīng)液中特定重金屬的可溶態(tài)總量(mg·L-1);VIV為各反應(yīng)器中反應(yīng)液的體積(L);CS是中藥樣品中特定重金屬的總量(mg·kg-1);MS為加入反應(yīng)器中的樣品質(zhì)量(kg)。

1.6 人體健康風(fēng)險評價方法

因為中藥中重金屬含量和攝入藥物量等都會對人體產(chǎn)生不同的健康影響，研究過程中按照相應(yīng)藥物說明書計算成人服用劑量，并模擬其他條件，分別計算出每日攝入各種中成藥的重金屬總量及可給態(tài)含量，再與世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的最大日允許攝入量(ADI)相比較[12]，即可評價正常暴露情況下普通人群通過中藥而攝入的全部或可給態(tài)重金屬對人體產(chǎn)生的健康風(fēng)險。

每日攝入量計算公式如下:

1)每日攝入某種重金屬全量(μg·d-1)

=中藥中該重金屬全量(mg·kg-1)×攝入劑量(g·d-1)

2)每日攝入某種重金屬可給態(tài)的量(μg·d-1)

=中藥中該重金屬全量(mg·kg-1)×生物可給性×攝入劑量(g·d-1)

3)每日攝入量占ADI 的百分比%

=每日攝入量(μg·d-1)/ADI 值(μg·d-1)

由于小腸是人體最主要的消化吸收器官，故主要以人工胃腸系統(tǒng)模擬小腸階段的生物可給性數(shù)據(jù)進行評價。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 添加雄黃中成藥中砷總量分析

對添加雄黃的中成藥中砷含量進行分析，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示，不同含雄黃中成藥中砷全量差異較大，其范圍在9.9×102～8.8×104mg·kg-1，含量最高者牛黃解毒片(編號A1)為8.8×104mg·kg-1。含雄黃中成藥中砷全量最低的也相當(dāng)于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標準》[13]砷限量值的500 倍，最高者則為標準值的4.4 萬倍。如果以更加嚴格的美國食品和藥物管理局的(FDA)[3]限量標準衡量，超標倍數(shù)更加驚人。此外，應(yīng)注意到不同廠家生產(chǎn)的同種中成藥(牛黃解毒丸和牛黃消炎片)中砷含量存在較大差異。以牛黃解毒片為例，6 種片劑分別取自不同的生產(chǎn)廠家，其中總砷的含量范圍為9.9×102～8.8×104mg·kg-1，最低值和最高值相差近百倍。

表1 添加雄黃的中成藥中總砷的含量Table 1 Contents of total As in some realgar-containing Chinese patent medicines

眾所周知，含雄黃的中成藥應(yīng)用廣泛，牛黃解毒片等更是家庭常用藥。特別值得注意的是，以上超標結(jié)果是針對中成藥中砷的全量。然而正如雄黃不同于劇毒的砒霜，重金屬元素的總量不能完全說明中成藥中砷的生物毒性，其生物毒性更大程度上由其生物有效態(tài)砷的含量所決定。以上結(jié)果恰恰表明，以全量去衡量添加含重金屬礦物類藥物的中成藥中重金屬對人體的危害程度缺乏合理性和準確性。因此，正確評價中成藥中砷對人體的健康風(fēng)險必須進一步進行重金屬生物有效性方面研究。此外，不同廠家生產(chǎn)的同種含雄黃中成藥中砷含量存在較大的差異，這些差異對其治療效果和對人體的毒性影響也成為我們關(guān)心的問題之一。

2.2 添加雄黃的中成藥砷可給性分析

添加雄黃中成藥中砷可給性結(jié)果如表2 所示，含雄黃中成藥中砷的生物可給性在胃階段為0.20%～2.17%，小腸階段為0.26%～2.43%。14 種中成藥中除喉癥丸(I2)胃階段及小腸階段生物可給性分別為2.17%和2.43%，其他中成藥中砷在人體胃腸模擬系統(tǒng)之中的可給性均在2%以下，即胃腸系統(tǒng)中溶出砷含量與中藥中總砷相比不足2%。

表2 添加雄黃中成藥中砷的生物可給性Table 2 Bioaccessibility of As in some realgar-containing Chinese patent medicines

目前，對于添加含重金屬礦物類藥材的中成藥中重金屬生物可給性研究較少。但有文獻報道[14]，牛黃解毒片中砷的全量為7×104mg·kg-1，但其生物可給態(tài)的砷僅占4%左右。梁國剛等[15]也認為中成藥中雄黃的主要成分不溶于水，難于被人體吸收發(fā)揮藥效。而本研究顯示:大多數(shù)(90%以上)中成藥中能夠溶于人體胃腸系統(tǒng)中的砷在總砷含量的2%以下，胃腸溶出的一部分砷會經(jīng)排泄系統(tǒng)排出體外，所以含砷中成藥中被溶出的砷能夠進入人體血液的量會更少，且被小腸吸收的砷對人體而言才是有效態(tài)的砷?？梢?，含雄黃的中成藥中能夠進入消化液并可被人體吸收的砷含量遠遠低于其全量。

2.3 添加雄黃的中成藥中砷的人體健康風(fēng)險初步評價

WHO 規(guī)定砷的最大日允許攝入量為128 μg·d-1，以此為評價標準，假設(shè)成年人(體質(zhì)量60 kg)按照相應(yīng)中成藥服用說明所標明的劑量服藥，分別以同一中成藥樣品砷全量及小腸階段的生物可給砷含量進行人體健康風(fēng)險評價，以其含量占ADI 的比例評價其對人體的風(fēng)險程度。結(jié)果如表3 所示，以中成藥砷全量結(jié)果計算，每日攝入砷含量占ADI 的比例結(jié)果依然驚人，其范圍在1 641% ～206 873%;而中成藥小腸階段生物可給含量占ADI 的比值范圍在11.20%～774.49%，14 種含雄黃中成藥中牛黃解毒片(A4、A5)、喉癥丸(I1、I2)等4 種中成藥中生物可給態(tài)砷含量與ADI 比值小于100%，對人體沒有明顯的健康風(fēng)險，其他10 種中成藥的結(jié)果均大于100%，對人體健康依然具有很大的風(fēng)險。

表3 添加雄黃中成藥中砷的攝入量Table 3 As intake from some realgar-containing Chinese patent medicines

特別值得注意的是，上文數(shù)據(jù)顯示的可給態(tài)砷含量較高，對人體風(fēng)險較大的中成藥均是療效和口碑俱佳的驗方國藥，而一般情況下按照標明用量服用極少出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。王躍生等[16]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，服用含砷中藥制劑后出現(xiàn)臨床中毒癥狀甚至死亡的病例多為服用了單味制劑或民間偏方，而服用成方制劑引起中毒的報道則較少。據(jù)趙雍等[17]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，近年因服用含雄黃中藥造成砷中毒的報道僅7 例。因此，臨床實際情況說明服用含雄黃的中成藥是可以保證安全的。

有研究顯示，雄黃對實驗動物腦含水量和海馬中乳酸含量的降低有一定的影響，并對腦缺血再灌模型大鼠腎組織中GPx 和CAT 活力的增加有一定影響[17]。而砷劑對多種疾病的療效也已得到確認[18-20]。由于As2S2溶解度很低，只有有效態(tài)的砷才能進入消化液被消化系統(tǒng)吸收從而進入人體，這部分砷有可能是治療病癥的有效成分。

當(dāng)然這并不能說明現(xiàn)在有中成藥配方都是最科學(xué)的狀態(tài)，前文數(shù)據(jù)顯示含雄黃中藥中砷的生物可給性絕大部分在2%以下，已有文獻[21-22]報道，雄黃的主要成分既不被機體吸收，又無藥理活性。此外，有報道稱含雄黃的中成藥與其他中藥或西藥配伍應(yīng)用，存在藥物毒性相加的問題[23]。中成藥中所含的如此大量的砷隨服藥過程進入人體消化系統(tǒng)，這本身就是用藥安全的“隱患”。

因此，中藥的現(xiàn)代化應(yīng)在尊重和繼承優(yōu)良傳統(tǒng)理論和經(jīng)驗的同時，以現(xiàn)代的先進科學(xué)手段為指導(dǎo)。所以，有必要從藥理學(xué)角度精確分析治療病癥所需的砷劑量，如其為必需成分則應(yīng)在制藥過程中定量加入，并在說明中注明服用劑量，危險劑量及服用禁忌等注意事項，如確為無效成分則應(yīng)該去除。以減小潛在的砷中毒風(fēng)險，更好地保障患者的生命健康。

綜上所述，得出以下結(jié)論:

(1)對含雄黃的中成藥樣品中砷全量分析結(jié)果顯示，含雄黃中成藥樣品中砷全量為9.9×102～8.8×104mg·kg-1，超過《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標準》砷限量值百倍至數(shù)萬倍。

(2)超過90%含雄黃中成藥中砷的生物可給性在2%以下，含雄黃的中成藥中砷在人體胃腸系統(tǒng)中溶出量遠遠低于其全量。

(3)對含雄黃成分中成藥中砷的人體風(fēng)險評價結(jié)果顯示，若以全量結(jié)果衡量，所有含雄黃中成藥均對人體健康具有巨大風(fēng)險;若以生物可給態(tài)砷的含量作為評價的基準，約30%的藥物中生物可給態(tài)砷含量與ADI 比值小于100%，不具人體健康風(fēng)險，其余10 種中成藥結(jié)果均大于100%，對人體健康依然具有較大的風(fēng)險。

[1] Chan K C.Some aspects of toxic contaminants in herbal medicines[J].Chemosphere,2003,52(9):1361－1371

[2] 周超凡.應(yīng)加強對朱砂、雄黃藥用價值的再評價[J].中國藥物經(jīng)濟學(xué),2007(3):18－21

[3] 陳建存.輸美中成藥受重金屬/化學(xué)品污染及違反FDA 規(guī)定情況[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2000,7(8):90－91

[4] 張暉芬,趙春杰.中藥材中重金屬的控制及其分析方法[J].中藥研究與信息,2004,6(5):10－12

[5] Yu C H,Yiin L M,Paul J L.The bioaccessibility of lead(Pb)from vacuumed house dust on carpets in urban residences[J].Risk Analysis,2006,26(1):125－134

[6] Ruby M V,Schoof R,Brattin W,et al.Advances in evaluating the oral bioavailability of inorganics in soil for use in human health risk assessment[J].Environmental Science&Technology,1999,33(21):3697－3705

[7] Kulp K S,Fortson S L,Knize M G,et al.An in vitro model system to predict the bioaccessibility of heterocyclic amines from a cooked meat matrix[J].Food and Chemical Toxicology,2003,41(12):1701－1710

[8] Rodriguez R R,Basta N T,Casteel S W,et al.An in vitro gastrointestinal method to estimate bioavailable arsenic in contaminated soil and solid media[J].Environmental Science&Technology,1999,33(4):642－649

[9] 唐翔宇,朱永官,陳世寶.In Vitro 法評價鉛污染土壤對人體的生物有效性[J].環(huán)境化學(xué),2003,22(5):503－505 Tang X Y,Zhu Y G,Chen S B.Assessment of lead bioaccessibility in contaminated soil using in vitro test[J].Environmental Chemistry,2003,22(5):503－505(in Chinese)

[10] 唐翔宇,朱永官.土壤中重金屬對人體生物有效性的體外試驗評估[J].環(huán)境與健康雜志,2004,21(3):183－185 Tang X Y,Zhu Y G.Advances in in vitro tests in evaluating bioavailability of heavy metals in contaminated soil via oral intake[J].Journal of Environment and Health,2004,21(3):183－185(in Chinese)

[11] 付瑾，崔巖山.In vitro 系統(tǒng)評價胃腸液pH 及土液比對鉛、鎘、砷生物可給性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2012,31(2):245－251 Fu J,Cui Y S.In vitro model system to evaluate the influence of pH and soil-gastric/intestinal juices ratio on bioaccessibility of Pb,Cd and As in two typical contaminated soils[J].Journal of Agro-Environment Science,2012,31(2):245－251(in Chinese)

[12] Lee H S,Cho Y H,Park S O,et al.Dietary exposure of the Korean population to arsenic,cadmium,lead and mercury[J].Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(s):S31－S37

[13] 中華人民共和國商務(wù)部.WM/T 2—2004 藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標準[S].北京:中國標準出版社,2005

[14] Koch I,Sylvester S,Lai V W,et al.Bioaccessibility and excretion of arsenic in Niu Huang Jie Du Pian pills[J]Toxicology and Applied Pharmacology,2007,222(3):357－364

[15] 梁國剛,張啟偉.朱砂、雄黃中各成分的溶解度對其藥效、毒副作用的影響[J].中國中藥雜志,2002,27(5):391－392

[16] 王躍生,張晶.對中藥成方制劑中重金屬問題的思考[J].中國中藥雜志,2000,25(6):377－379

[17] 趙雍,曹春雨,王秀榮,等.含與不含朱砂、雄黃的安宮牛黃丸對大鼠局灶性腦缺血的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,22(9):684–686 Zhao Y,Cao C Y,Wang X R,et al.Effect of Angong Niuhuang pill containing or not containing Cinnaba and realgar on cerebral focal ischemia in rats[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2002,22(9):684－686(in Chinese)

[18] 傅衛(wèi)軍,侯健,王東星,等.氧化砷誘導(dǎo)骨髓瘤細胞株(KM3)凋亡的初步研究[J].中華血液學(xué)雜志,1998,19(11):591－592

[19] 馬軍.三氧化二砷在白血病治療中的臨床應(yīng)用[J].中國處方藥,2004(10):17－20 Ma J.The Application of arsenic trioxide in the treatment of leukemia[J].China Prescription Drug,2004,(10):17－20(in Chinese)

[20] Emadi A,Gore S D.Arsenic trioxide—An old drug rediscovered[J].Blood Reviews,2010,24(4-5):191－199

[21] 王金華,葉祖光,梁愛華,等.安宮牛黃丸中汞、砷在正常和腦缺血模型大鼠體內(nèi)的吸收與分布研究[J].中國中藥雜志,2003,28(7):639–642 Wang J H,Ye Z G,Liang A H,et al.Absorption and distribution of mercury and arsenic from realgar and cinnabar of Angong Niuhuang pill in normal rats and rats with cerebral ischemia[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2003,28(7):639－642(in Chinese)

[22] 全燦,戴新華,徐蓓,等.中藥安全及其標準物質(zhì)研究[J].中草藥,2007,38(10):1441－1445 Quan C,Dai X H,Xu B,et al.Safety issues of Chinese materia medica and its reference material research[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2007,38(10):1441－1445(in Chinese)

[23] 張麗君,趙安民.朱砂名稱作用及毒性考略[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2001,19(5):529