脂氧素受體激動劑BML－111對左向右分流大鼠肺動脈壓力影響及其機(jī)制的研究※

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗科（十堰442000）

陳永梅 周作華 趙 穎 陳 玲 孫 曼 龔興瑞△ 向 勇△▲

肺動脈高壓是眾多臨床心臟和肺部疾病發(fā)展的終末階段，其中炎癥反應(yīng)是肺動脈發(fā)展過程中一種極為重要的因素，它可促使肺血管阻力增加，肺動脈壓力進(jìn)行性升高，從而血管痙攣收縮、血管壁重建及原位血栓形成［1］。脂氧素是一種促炎癥消退物質(zhì)，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞異常增殖，抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞激活的作用，其已闡明的作用機(jī)制決定了它有可能具有治療肺動脈高壓的作用［2，3］。本試驗擬采用脂氧素受體激動劑處理左向右分流型大鼠，觀察其對肺動脈壓力的影響，并進(jìn)一步探求其與作用機(jī)制。

材料與方法

1 動物與器械 健康成年SD大鼠30只，體重400～450g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供。實驗器材準(zhǔn)備包括：壓力換能器、顯微鏡、手術(shù)顯微器械、肝素、水合氯醛、鹽酸戊乙奎醚、青霉素等。

2 模型制備 將100ml水合氯醛中加入鹽酸戊乙奎醚注射液1mg和氟哌利多5mg，采用3ml／100g的劑量腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手術(shù)臺上，2mg／kg肝素行腹腔注射，術(shù)中持續(xù)面罩給氧。將P組、B組大鼠沿左側(cè)頸部斜形剪開，游離左側(cè)頸總動脈和頸外靜脈，頸外靜脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，頸總動脈下段用血管夾夾住，于發(fā)出頸外動脈分支前結(jié)扎剪斷，將BD20G的動脈穿刺針剪取1cm作為導(dǎo)管連接頸總動脈近端和頸外靜脈近端，聯(lián)接牢固后固定導(dǎo)管，松開血管夾，頸外靜脈變紅且有搏動則說明分流成功，縫合傷口前局部噴灑青霉素5萬單位。C組僅行麻醉和局部切開操作。將大鼠放回籠中，飼養(yǎng)6周后，B組每天腹腔注射1mg／kg BML－111，P組每天腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)4周后將大鼠取出進(jìn)行實驗。

3 肺動脈壓力測量 將大鼠按照如前的方式行腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手術(shù)臺上，分離右側(cè)頸外靜脈，將右心導(dǎo)管充滿肝素鹽水后插入，連接換能器并與監(jiān)護(hù)儀相連，當(dāng)置入導(dǎo)管進(jìn)入右心室時記錄其右室收縮壓，監(jiān)護(hù)儀出現(xiàn)肺動脈波形時記錄其平均肺動脈壓力，連續(xù)三次讀數(shù)，計算其平均值。壓力測量完畢后處死大鼠，游離右室（RV）和左室＋室間隔（LV＋S）并稱重，計算（RV）／（LV＋S）。

4 組織病理學(xué)測定 用生理鹽水沖洗肺動脈剩余的血液，同時用10%的中性甲醛在20cmH2O壓力下經(jīng)氣管注入肺內(nèi)，約5min后切取左肺于10%甲醛中固定48h，常規(guī)石蠟包埋、切片。

4．1 肺小動脈中膜厚度比 將處理好的切片采用Elastin－Van Gieson染色，光鏡下觀察用SimplePCI圖像采集系統(tǒng)處理，分別測量計算內(nèi)、外彈力板之間的距離R和血管外徑D，每只大鼠測量30根肺部小動脈，直徑位于30～100μm，由公式計算中膜厚度百分比：2R／D100%。

4．2 肺小動脈纖維化比 將處理好的標(biāo)本經(jīng)Masson染色，在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，用圖像處理軟件將藍(lán)染的纖維組織和紅色的其它組織以及白色的背景分割開，計算藍(lán)染組織占總視野百分比。

4．3 肺組織 MMP－2，9、TIMP－1含量的測定將處理好的切片用免疫組織化學(xué)SP法染色肺組織，以胞膜和胞漿呈棕黃色顆粒為 MMP－2，9、TIMP－1表達(dá)陽性，無棕黃色顆粒者為表達(dá)陰性，采用Image－Pro Plus圖像分析系統(tǒng)在400倍光鏡下進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)抽取五個視野作為測定目標(biāo)，采用IOD行半定量分析。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 本組對所有數(shù)據(jù)采用SPSS13．0統(tǒng)計分析，選用完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析，采用最小有意義極差法（LSD）分析各組與對照組之間的比較，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況 見表1。P、B兩組大鼠分流術(shù)后有部分大鼠表現(xiàn)為進(jìn)食減少，毛發(fā)變粗，活動較差。P、B兩組大鼠體重增長減慢，術(shù)前三組大鼠體重?zé)o顯著性差異，術(shù)后6周，C組大鼠體重重于P、B兩組，第10周C組體重重于P、B兩組大鼠，且B組體重高于P組。

表1 各組大鼠體重變化情況（g，±s）

表1 各組大鼠體重變化情況（g，±s）

注：※與C組比較，P＜0．05；＃與P組比較，P＜0．05

測量指標(biāo) 術(shù)前 第6周 第10周C組 416±12 462±14 486±18 P組 420±13 446±13※ 454±15※B組 419±15 443±15※ 468±16※＃

2 血流動力學(xué)改變 見表2。經(jīng)術(shù)后10周的飼養(yǎng)，P組和B組大鼠PAMP、RVSP均較C組升高，且P組比B組升高明顯（P＜0．05），大鼠處死后，P組和B組RV／（LV＋S）較C組增加顯著（P＜0．05）。

3 中膜厚度及纖維化的比較 見表3P組和B組大鼠相比C組肺組織中膜厚度比和纖維化比增高，且P組比B組增加更明顯（P＜0．05）。

表2 各組大鼠PAMP、RV／（LV＋S）、RVSP（±s）

表2 各組大鼠PAMP、RV／（LV＋S）、RVSP（±s）

注：※與C組比較，P＜0．05；＃與P組比較，P＜0．05

測量指標(biāo) PAMP（mmHg）RV／（LV＋S） RVSP（mmHg）C 組 13．2±2．2 0．221±0．021 22．2±3．3 P組 30．4±4．1※ 0．304±0．031※ 37．7±5．2※B組 26．6±3．7※＃ 0．264±0．031※ 31．8±4．4※＃

表3 各組大鼠中膜厚度比和纖維比（±s）

表3 各組大鼠中膜厚度比和纖維比（±s）

注：※與C組比較，P＜0．05；＃與P組比較，P＜0．05

測量指標(biāo) 中膜厚度百分比 纖維化百分比C組 12．3±2．5 15．6±5．8 P組 25．1±4．9※ 34．6±7．8※B組 20．6±3．4※＃ 26．3±6．9※＃

4 MMP－2、MMP－9、TIMP－1水平比較 見表4。P組和B組大鼠相比C組肺組織 MMP－2、MMP－9、TIMP－1含量增高，且P組比B組增加更明顯（P＜0．05）。

表4 各組大鼠MMP－2、MMP－9、TIMP－1水平（±s）

表4 各組大鼠MMP－2、MMP－9、TIMP－1水平（±s）

注：※與C組比較，P＜0．05；＃與P組比較，P＜0．05

測量指標(biāo) MMP－2 MMP－9 TIMP－1 C 組 32．6±6．2 35．8±8．7 30．4±5．9 P組 76．8±15．6※ 69．4±12．8※ 82．6±18．2※B組 58．3±12．9※＃ 52．2±11．4※＃ 61．6±14．4※＃

討 論

肺動脈高壓在先天性疾病中發(fā)生率比較高，主要表現(xiàn)為肺動脈壓力進(jìn)行性升高，右心壓力升高，右心室肥厚，如果不及時干預(yù)，難免發(fā)展到不可逆的階段，最后常導(dǎo)致右心衰竭，病人死亡［4］。在近年來的研究中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，如肺動脈高壓病變過程中常伴隨著炎癥因子如白介素、腫瘤壞死因子、核因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等的變化，因此通過抑制炎癥反治療肺動脈高壓被認(rèn)為是一個有效的辦法［5］?；|(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞外基質(zhì)一種與降解膠原蛋白相關(guān)的水解酶，它可以影響而細(xì)胞外基質(zhì)的改變包括膠原蛋白的變化和彈性蛋白的變化，在細(xì)胞外基質(zhì)生長增殖的過程中起到重要調(diào)節(jié)作用。此外它還參與肺動脈血管平滑肌的增殖和遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的變化也是肺動脈高壓發(fā)展過程中的一個因素，已有實驗證明抑制MMP的表達(dá)，有助于減輕肺部炎癥和血管重構(gòu)，延緩肺動脈高壓的形成［6，7］。

脂氧素是體內(nèi)重要的促炎癥消退介質(zhì)，它通過激活脂氧素受體發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用，而BML－111作為一種脂氧素受體激動劑也可以通過作用于脂氧素受體而發(fā)揮相同的作用［8］。在本試驗中采用導(dǎo)管聯(lián)接左頸總動脈－頸外靜脈建立大鼠左向右分流型肺動脈高壓動物模型，模型建立后于第六周開始行腹腔注射干預(yù)，三組大鼠，在實驗開始時體重?zé)o差異，隨著分流導(dǎo)致肺動脈高壓的逐漸形成，P組和B組生長放緩，但P組生長更慢。大鼠處死前P組和B組測量的肺動脈壓力、右心室收縮壓均比C組升高，P組升高更明顯，大鼠處死后測得RV／（LV＋S）、中膜厚度比和纖維化比值P組和B組明顯增大，說明右室肥厚明顯，肺血管病理改變嚴(yán)重。采用半定量測得P組和B組MMP－2、MMP－9、TIMP－1升高，且P組比B組更明顯，說明P組和B組兩組大鼠肺部炎癥反應(yīng)較重，而加入BML－111有助于減輕大鼠肺部炎癥。

本研究B組大鼠加入BML－111，可減輕左向右分流型大鼠肺動脈高壓的進(jìn)展，減輕右室肥厚及肺部血管病理改變，其作用機(jī)制可能與BML－111抑制大鼠肺組織 MMP－2，9表達(dá)，增強(qiáng)TIMP－1的表達(dá)有關(guān)。

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