山東地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定

摘要：從山東某地區(qū)發(fā)生呼吸道癥狀的奶牛場(chǎng)中采集樣品，按常規(guī)方法處理后，接種牛腎細(xì)胞（MDBK），分離病毒，盲傳3代后，接種病料的MDBK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、聚集成葡萄串樣群落、在單層細(xì)胞上形成空洞等病變，且隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞病變更加規(guī)律。對(duì)所分離病毒進(jìn)行TCID50測(cè)定，其TCID50值為108/ml；用IBRV特異性引物對(duì)分離病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與設(shè)計(jì)基因片段大小一致的特異性條帶，序列測(cè)定分析結(jié)果確認(rèn)所分離病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒。

關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎病毒；分離鑒定；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.237.7（252）文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0028-03

牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV）引起的牛傳染性鼻氣管炎是牛的主要呼吸道疾病之一。臨床以病牛體溫升高、呼吸困難、鼻炎和上流鼻涕及鼻孔內(nèi)出現(xiàn)糜爛或白色結(jié)節(jié)為特征，還可導(dǎo)致生殖道感染從而進(jìn)一步導(dǎo)致母畜流產(chǎn)及產(chǎn)死胎等病癥，繼發(fā)性的細(xì)菌感染能導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病[1～3]。美國(guó)于1955年首次發(fā)現(xiàn)以傳染性鼻氣管炎癥狀為特征的疾病，1956年Madin首次從患牛中分離出IBRV，20世紀(jì)70年代起蔓延整個(gè)歐洲。迄今為止，世界大多數(shù)國(guó)家都有發(fā)生牛傳染性鼻氣管炎的報(bào)道，同時(shí)IBR根除計(jì)劃在其他一些國(guó)家開(kāi)始實(shí)施[4]。我國(guó)于20世紀(jì)70年代末從新西蘭進(jìn)口的奶牛中分離到一株IBRV，隨后陸續(xù)從國(guó)內(nèi)部分省份的血清學(xué)調(diào)查中檢測(cè)到IBR抗體的存在[5]。該病主要影響奶牛繁殖能力、產(chǎn)奶量及使役牛的使役能力，嚴(yán)重影響著國(guó)際牛業(yè)生產(chǎn)貿(mào)易，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類(lèi)傳播性疾病，也被我國(guó)列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病[6]。

2012年本研究室對(duì)山東某地區(qū)發(fā)生呼吸道癥狀的奶牛場(chǎng)進(jìn)行樣品采集，進(jìn)行處理后接種細(xì)胞盲傳，經(jīng)培養(yǎng)分離到一株牛傳染性鼻氣管炎病毒，同時(shí)我們還對(duì)病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1供試材料

MDBK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；IBRV標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸緩沖液（PBS）、DMEM培養(yǎng)液、胰酶均購(gòu)自Invitrogen公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；LA Taq with GC buffer、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；T3載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2病毒的分離培養(yǎng)

將MDBK細(xì)胞傳代，細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按0.5 ml每皿（100 mm培養(yǎng)皿）接種分離獲得的無(wú)菌血液樣品，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h（間隔30 min輕搖一次）；去除接種液，用PBS沖洗2次，加入7 ml含有2%FBS的維持液，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變（CPE），待70%～80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒；如果細(xì)胞不出現(xiàn)CPE，則7天后盲傳，分離物傳至第3代。

1.3病毒TCID50的測(cè)定