牛流行熱病毒山東地方株的分離與鑒定

摘要：利用BHK-21細(xì)胞，接種山東濟(jì)南地區(qū)疑似牛流行熱病牛高熱期的抗凝血，經(jīng)盲傳3代，分離到1株病毒，經(jīng)RT-PCR鑒定為牛流行熱病毒，命名為BEFV-SD。理化特性試驗(yàn)表明：BEFV-SD對(duì)熱敏感，56℃ 10 min、37℃18 h可被滅活，對(duì)乙醚、氯仿等敏感；BEFV-SD可被BEFV陽(yáng)性血清中和，中和效價(jià)為1∶408；將BEFV-SD的G基因與GenBank中公布的BEFV進(jìn)行同源性比較，同源性達(dá)到96.3%以上。

關(guān)鍵詞：牛流行熱病毒；分離；鑒定；同源性

中圖分類(lèi)號(hào)：S855.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0031-04

牛流行熱 （Bovine Ephemeral Fever，BEF）是由牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）引起的牛和水牛的一種急性、熱性傳染病，其特征是突發(fā)高熱、呼吸迫促、消化機(jī)能障礙、全身虛弱、僵硬、跛行[1]。首先發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)中期的東非，隨后流行于非洲、亞洲和大洋洲許多國(guó)家和地區(qū)[2～5]。本病流行具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于雨量多和氣候炎熱的7～10月。該病傳播迅速，流行面廣，有一定的周期性[6]，曾在我國(guó)多個(gè)省份多次發(fā)生，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，乳品質(zhì)下降，役用牛跛行或癱瘓，部分懷孕母牛流產(chǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室采集了疑似患牛流行熱病牛高熱期的抗凝血，進(jìn)行了病原分離，經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)鑒定，證實(shí)分離獲得了牛流行熱病毒。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1病料來(lái)源采集山東省濟(jì)南市周邊出現(xiàn)急性發(fā)熱、呼吸道和消化道機(jī)能障礙的奶牛高熱期的靜脈血，肝素鈉抗凝，-20℃保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料100 mm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板為Costar產(chǎn)品，DMEM營(yíng)養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Giboco公司，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自大連寶生物工程公司，瓊脂糖、溴化乙腚等試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司，BHK-21細(xì)胞為山東省農(nóng)科院奶牛研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)牛流行熱病毒主要免疫保護(hù)性糖蛋白G（BEFV-G）的保守核苷酸序列 （GenBank登錄號(hào)為AF234533.1） 設(shè)計(jì)引物BEFJ1（5′-AGAGCTTGGTGTGAATAC-3′）和BEFJ2（5′-CCAACCTACAACAGCAGATA-3′），擴(kuò)增片段大小為420 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒的分離與傳代將臨床疑似牛流行熱的病?？鼓磸?fù)凍融3次后，4℃離心（4 000 r/min）5 min后取上清，接種于長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，37℃吸附1 h，加入含有2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，連續(xù)3 d觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），若未發(fā)生CPE盲傳3代，仍未出現(xiàn)CPE且RT-PCR鑒定為陰性者廢棄，陽(yáng)性者繼續(xù)傳代，直至出現(xiàn)CPE，當(dāng)出現(xiàn)80%CPE時(shí)收毒，凍融3次后，繼續(xù)傳代3次。經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，小管分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?。并按方?.2.2進(jìn)行病毒的RT-PCR鑒定。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)病牛的抗凝血及培養(yǎng)病毒液反復(fù)凍融3次后，用病毒RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1.8 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.7 μl，模板DNA 1.5 μl， Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，加三蒸水至25 μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3病毒理化特性試驗(yàn)對(duì)分離毒種的第6代BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行理化特性鑒定，用終濃度50 mg/L的5-碘脫氧尿核苷處理分離毒種，鑒定病毒的核酸型；用乙醚、氯仿處理分離毒種，進(jìn)行脂溶性敏感試驗(yàn)；用pH 3.0的鹽酸處理分離毒株進(jìn)行耐酸性試驗(yàn)；56℃水浴10～30 min，37℃孵育12～36 h，對(duì)分離毒株進(jìn)行耐熱性試驗(yàn)，同時(shí)分別設(shè)立對(duì)照組。

1.2.4中和試驗(yàn)采用固定病毒稀釋血清的方法，將200 TCID50/100μl分離株病毒液與等量的不同倍比稀釋度的BEFV陽(yáng)性血清充分混合， 37℃感作1 h，將每個(gè)混合液接種于棄去生長(zhǎng)液的長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃吸附1 h后，每孔加細(xì)胞維持液 100 μl，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d，逐日觀察CPE 情況并記錄。同時(shí)設(shè)立血清毒性對(duì)照、陰性血清對(duì)照和空白試驗(yàn)對(duì)照。

1.2.5分離病毒株的G蛋白編碼區(qū)的克隆測(cè)序及其同源性比較對(duì)分離病毒株進(jìn)行RNA提取，然后進(jìn)行G蛋白編碼區(qū)的RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為1 872 bp，純化PCR產(chǎn)物，克隆到T3載體，送上海生工測(cè)序，對(duì)獲得分離株的G蛋白序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1分離病毒可見(jiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)

將臨床疑似牛流行熱的病?？鼓臃N長(zhǎng)滿80%的單層BHK-21細(xì)胞，盲傳3代后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，特征為細(xì)胞開(kāi)始變圓，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，融合成小集落（見(jiàn)圖1B），然后細(xì)胞全部變圓（圖1C），脫落死亡。將獲得的病毒進(jìn)行繼代培養(yǎng)，傳至3代后，細(xì)胞病變規(guī)律、典型，將此分離毒株命名為BEFV-SD。