核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化及檢測技術(shù)研究進展

摘要：綜述了近年來國內(nèi)外常見核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展，概述了目前果樹遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，闡述了核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化植株的主要鑒定方法，指出了當前研究中存在的一些問題，探討了轉(zhuǎn)基因研究未來的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：核果類果樹；遺傳轉(zhuǎn)化；檢測技術(shù)；發(fā)展方向

中圖分類號：S662；Q789文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）04-0130-07

核果類果樹是指薔薇科李屬（Prunus）、果實為核果的一類果樹，包括桃、杏、李和櫻桃等，是我國落葉果樹的重要種類。果樹長期的育種實踐表明，常規(guī)雜交育種方法對核果類果樹種質(zhì)改良有很大的局限性；基因工程育種周期短，基因資源豐富，能最大限度地克服物種生殖隔離的障礙，實現(xiàn)生物界遺傳物質(zhì)的自由交流。自1988年首例轉(zhuǎn)基因核桃成功報道以來[1]，基因轉(zhuǎn)化方面的研究在果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究上得到了廣泛應(yīng)用，其在果樹遺傳改良中的作用越來越受到重視。本文主要綜述了近年來國內(nèi)外在核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化方面所取得的進展，為基因工程育種提供參考和借鑒。

1常見核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀

11桃

桃轉(zhuǎn)基因難度較大，多數(shù)研究只獲得了轉(zhuǎn)基因的愈傷組織而未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。1991年Smigocki和Hammerschlag[2]用未成熟桃胚為外植體，經(jīng)過愈傷組織誘導和再分化，成功將細胞分裂素合成酶基因（IPT）導入了桃，這是世界上首例也是目前為止唯一公開報道的轉(zhuǎn)基因桃實例。農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法在桃遺傳轉(zhuǎn)化研究中均有報道[3～6]。

Smigocki等[8]早期利用Ti質(zhì)粒中含細胞分裂素合成酶基因和生長素酶突變基因的根癌農(nóng)桿菌與桃的成熟細胞共培養(yǎng)進行感染，獲得了桃轉(zhuǎn)化細胞及愈傷組織。Martin[9]曾用2種發(fā)根農(nóng)桿菌和8種根癌農(nóng)桿菌感染桃，證明了以GUS基因作為桃遺傳轉(zhuǎn)化的報告基因和測試包含GUS基因標記系統(tǒng)的農(nóng)桿菌的有用性。Ognjanow[10]用帶有GUS基因的農(nóng)桿菌感染桃子葉轉(zhuǎn)化體，GUS熒光檢測與陰性對照明顯不同。Hammerschlag等[11]用農(nóng)桿菌tma328∶tn5轉(zhuǎn)化桃成年樹離體莖段，均產(chǎn)生了腫瘤組織，并表現(xiàn)出不依賴細胞分裂素的特性，轉(zhuǎn)化體DNA呈陽性，初次說明了成年桃樹的細胞能夠被轉(zhuǎn)化及根癌菌具有轉(zhuǎn)化重要基因到桃樹上的潛能。1991年他們又用tma328∶tn5感染未成熟桃胚，將共培養(yǎng)后的外植體接種在無激素的MS培養(yǎng)基上，誘導產(chǎn)生愈傷組織，這些愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化產(chǎn)生了芽。Ye等[6]用基因槍法轟擊桃未成熟胚、胚軸、子葉、莖尖、葉片和長期胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化GUS/NPTⅡ嵌合基因，所有類型的外植體均獲得了GUS基因瞬時表達，并在長期胚性愈傷組織中得到穩(wěn)定表達。他們篩選出了桃組織遺傳轉(zhuǎn)化的最優(yōu)組合，并用微粒轟擊法使外源基因成功導入桃胚愈傷組織并得到穩(wěn)定表達。金勇豐等[12，13]已先后從桃品種“玉露”克隆了ACC氧化酶和ACC合酶的基因，且已構(gòu)建其反義植物表達體系，若轉(zhuǎn)化桃獲得成功，可望阻抑果實軟化期該基因的表達，從而提高果實的耐貯性。現(xiàn)已成功獲得導入了ACC氧化酶反義基因的轉(zhuǎn)基因桃植株[12]，目前正在培育以觀察轉(zhuǎn)基因果實的性狀。

李曜東等[14]將肥城桃反義PG基因通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化組培苗，轉(zhuǎn)化苗在含卡那霉素培養(yǎng)基上篩選，獲得抗卡那霉素轉(zhuǎn)基因苗。吳延軍等[15]以桃幼胚作為根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的受體，通過GUS基因瞬時表達率的分析，研究出了該轉(zhuǎn)化體系的最佳實驗參數(shù)，GUS瞬時表達率最高。Pérez-Clemente等[3]2004年報道以GFP為內(nèi)部標記鑒定轉(zhuǎn)基因桃樹。萬春雁等[7]2009年對桃花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行初步研究，探索一種建立于組織培養(yǎng)之外的轉(zhuǎn)基因方法。

12李

除了桃，其它核果類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究也得到廣泛開展。1991年，Mante等[16]首先實現(xiàn)了西洋李轉(zhuǎn)基因，目前已在波蘭、羅馬尼亞和西班牙等3個不同氣候條件的國家進行了溫室和大田試驗。Scorza等[17，18]在李樹上轉(zhuǎn)化木瓜環(huán)斑病毒（PRV）外殼蛋白基因，并就轉(zhuǎn)基因植株對李痘病毒（PPV）的反應(yīng)進行了初步研究。1994年，Scorza等[19]成功利用帶有重組質(zhì)粒PGA482 gg/PPV-CP-33的致瘤農(nóng)桿菌與下胚軸切段共培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)PPV外殼蛋白基因的歐洲李轉(zhuǎn)基因莖，在歐洲和地中海地區(qū)用于防治核果類重要病害的發(fā)生。Ravelonandro等[20～23]先后幾年致力于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抵御李痘病侵染的研究；Yancheva等[24]利用農(nóng)桿菌介導法進行了李樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究；Malinowski等[25]2006年成功進行了李樹轉(zhuǎn)PPV-CP基因的田間試驗；2008年Urtubia等[26]在中國李子兩個變種“Angeleno”和“Larry Anne”上用農(nóng)桿菌GV3101介導轉(zhuǎn)化NPTⅡ和GFP兩種基因，并成功進行了檢測；2011年，Ilardi等[27]研究并報道了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防止李痘病毒在草本寄主和核果類果樹上侵染的相關(guān)研究成果。至今，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在李樹上的應(yīng)用已取得了一定成績，并在一直不斷地研究與進步。

13杏

1992年Machado等[28]首次通過致瘤農(nóng)桿菌將PPV外殼蛋白基因成功轉(zhuǎn)入杏的Kecskemeter品種，是杏轉(zhuǎn)基因的首次成功。而后，Machado等[29]又進行了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在草本模式寄主以及杏、李上防治PPV的相關(guān)研究。2004年，Petri等[30]以杏樹葉片為試材，對農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的影響因素進行了優(yōu)化研究，并成功篩選出最優(yōu)因子。隨后，有人對氨基糖苷類抗生素[31]、植物生長素、多胺與乙烯抑制劑等因素對轉(zhuǎn)基因杏樹葉組織選擇及再生作用進行了研究報道[32]；也有研究表明，轉(zhuǎn)化PRV外殼蛋白到杏樹上會提高杏樹對PPV的抗性 [17，18，33]。2007年，宮雪超等[34]報道了利用Southern雜交法對轉(zhuǎn)基因杏和柑橘進行檢測與鑒定?？傊?，杏樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究已在方法、效率以及檢測等方面取得了巨大進步。

14扁桃

1995年，Archilleti等[35]報道了用含有NPTⅡ基因的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化扁桃品種MN51和Supernova葉片，試驗了不同的細菌濃度、共培養(yǎng)時間和卡那霉素選擇前的培養(yǎng)時間，以期建立有效的轉(zhuǎn)化和再生體系。Miguel等 [36]于1999年獲得第一株轉(zhuǎn)基因扁桃植株，他用離體培養(yǎng)的葉片外植體為起始材料首次建立了表達NPTⅡ和GUS基因的扁桃品種Boa Casta轉(zhuǎn)基因克隆，有3個克隆是嵌合體；與帶有相同質(zhì)粒的菌株LBA4404相比，EHA105轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的GUS陽性頻率和GUS表達單位更高。2000年，Ainsley [37]對扁桃基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展進行了論述；Ramesh等[38]于2006年對以扁桃為材料的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行了部分改進，建立了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系，扁桃遺傳轉(zhuǎn)化取得了較快進展。

15櫻桃

第一例轉(zhuǎn)基因櫻桃于1998年首次報道[39]，1999年Dolgov等[45]報道了酸櫻桃的重組轉(zhuǎn)化，我國科學家方宏筠等[40]也于1999年成功地將抗菌肽基因?qū)霗烟?。Bhagwat等[41]2004年報道了甜櫻桃拉賓斯和甜心的體外遺傳重組；Song等[42]于2005年對酸櫻桃農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化瞬時表達因素及芽再生條件進行了優(yōu)化，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在櫻桃上的應(yīng)用獲得了較快發(fā)展。張開春等[43]從圓葉櫻桃中克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)操縱櫻桃果實的成熟和軟化奠定了良好的基礎(chǔ)。Dolgov等[44，45]已獲得7個含有抗凍基因的酸櫻桃轉(zhuǎn)化系，目的是為了防止春季霜凍時細胞內(nèi)冰晶形成，但遺憾的是未在轉(zhuǎn)化植物中表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

用6個不同的帶有pBI121的野生型農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化酸櫻桃，獲得了含有NPTⅡ和GUS基因的轉(zhuǎn)基因莖[46]。在一種顯著抗霜凍櫻桃砧木（Psubhirtella cv.autumnorosa）中，用致瘤農(nóng)桿菌介導的GUS基因轉(zhuǎn)化實驗測定了胚性培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化效率[47]。用基因槍法和農(nóng)桿菌介導法將35S啟動子和CAM啟動子引導的帶有BAR和GUS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入櫻桃矮化砧木Inmil（P incisa×P.serrulata GM9）和Damil（Pdawyckensis GM61/1）以及甜櫻桃品種Summit（P avium L），在未加選擇劑的情況下產(chǎn)生了嵌合的再生植株[48]。總之，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在櫻桃育種方面取得了較快發(fā)展。

2核果類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化方法及影響因素

21農(nóng)桿菌介導法

農(nóng)桿菌的體內(nèi)含有一些很大的質(zhì)粒，在原質(zhì)粒上有一段DNA稱為T-DNA，在土壤農(nóng)桿菌侵入細胞時，T-DNA能夠插入植物細胞的基因組并穩(wěn)定遺傳給新分裂的細胞。人們利用T-DNA的這一特點，將其中能導致植物形成腫瘤的基因全部切除，換上需要的目的基因，就組成了一個可將目的基因帶進植物細胞中去的載體。目前，核果類轉(zhuǎn)基因最常用的方法是農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化過程是把Ti質(zhì)粒的T-DNA片段轉(zhuǎn)移到植物的核基因組。此方法的轉(zhuǎn)化效率受以下幾方面因素的影響：（1）細菌的菌株對轉(zhuǎn)化頻率影響很大。在核果類果樹上最常用的Ti質(zhì)粒菌株為LBA4404、EHA105和EHA101，而常用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株則是1855NCPPB和ATCC15834，外植體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間一般為24～36 h，向培養(yǎng)基中加入抗生素（如：羧芐青霉素）來抑制細菌的生長，共培養(yǎng)后，除菌十分關(guān)鍵；（2）轉(zhuǎn)化細胞的選擇。常用卡那霉素，因為核果類的大多數(shù)種質(zhì)對卡那霉素高度敏感，卡那霉素的濃度和加入時間根據(jù)外植體和物種的不同進行預先實驗；（3）轉(zhuǎn)化細胞能否高效地再生是轉(zhuǎn)化的主要問題，核果類果樹再生困難；（4）導入的外源DNA在植物基因組中的穩(wěn)定性，避免外源基因的瞬時表達和形成嵌合體。

22基因槍法

基因槍是1987年美國康奈爾大學Sanford等人首先發(fā)明的，是憑借高速運動的金屬微粒將附著其表面的核酸分子引入到受體細胞中的一種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)[49]?；驑尫ㄒ渤Ｓ糜诠麡涞倪z傳轉(zhuǎn)化，基因槍微彈轟方法可用于任何植物組織的轉(zhuǎn)化，而且報告基因的瞬時表達便于分析基因表達的組織特異性，但獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率較低。Ye等[6]用基因槍轟擊桃外植體

轉(zhuǎn)化GUS/NPTⅡ嵌合基因，并在長期胚性愈傷組織中得到GUS基因的固定表達。此方法的轉(zhuǎn)化效率受以下幾方面因素的影響：（1）基因槍轟擊參數(shù)：DNA 包裹和射擊過程中的各種物理參數(shù)因基因槍類型不同而有所差別。以PDS-1000/He 型基因槍為例，金粒形狀較均勻，對受體細胞沒有太大的損傷，轉(zhuǎn)化效果較好。氦氣的壓力是決定金屬粒子飛行速度的主要因素，壓力過大會對植物細胞造成傷害，壓力過小，金屬粒子不能進入細胞。此外，金屬粒子大小、載體膜的位置和靶材料的位置等參數(shù)，也與其他射擊參數(shù)相互聯(lián)系，應(yīng)根據(jù)實驗具體設(shè)置。（2）微彈射程：微彈射程指基因槍擋板與靶細胞間的距離，它是影響基因轉(zhuǎn)化率的重要因素，植物組織中只有特定的細胞具有再生能力，需根據(jù)受體材料選擇合適的距離；轉(zhuǎn)化率與彈膛內(nèi)的真空度呈正相關(guān)關(guān)系，但要考慮靶細胞對真空度的耐受性；適當?shù)霓Z擊次數(shù)有利于目的基因的表達，轟擊次數(shù)過多往往會使轟擊細胞損傷嚴重，降低轉(zhuǎn)化率；DNA 的純度和濃度均會影響轉(zhuǎn)化率，目前普遍采用的DNA 濃度為1 g/L；氯化鈣與亞精胺常用作DNA 的沉淀劑，其濃度對轉(zhuǎn)化率也有影響。Klein 報道氯化鈣的最適宜濃度為19～24 mol/L，亞精胺的最適宜濃度為769×10-3～769×10-3 mol/L[49]。（3）受體的生理因素：受體的生理因素主要指受體細胞或組織的生理狀態(tài)。一般認為，生理活性高的組織或細胞有利于外源DNA 的攝入與整合，選用再生能力強的外植體作為轉(zhuǎn)化受體，提高轉(zhuǎn)化率。

主要的基因轉(zhuǎn)化方法除了上述兩種方法外，還有微注射法、電擊法和花粉管通道法[7]。如Vardi等[50]用PEG法將CAT基因和NPTⅡ基因?qū)霗幟试|(zhì)體獲得再生植株；Oliveira[51]用電擊法及PEG法轉(zhuǎn)化獼猴桃原生質(zhì)體獲得成功。木本果樹遺傳轉(zhuǎn)化上應(yīng)用的方法還有DNA直接攝取法[52]、碳化硅法[53]、電泳法[54]等。

3轉(zhuǎn)基因植株的檢測鑒定

遺傳轉(zhuǎn)化后，先通過抗性篩選獲得抗性芽后生成植株，再對抗性植株進行檢測，檢測陽性的植株才是真正的轉(zhuǎn)基因植株。常用的檢測方法有GUS活性檢測、PCR技術(shù)雜交檢測、免疫學檢測。

31GUS活性檢測

GUS基因是研究外源基因瞬時表達轉(zhuǎn)化試驗中的報告基因。GUS 基因3′端與其他結(jié)構(gòu)形成的融合基因能正常表達，所產(chǎn)生的融合蛋白仍具有GUS 活性，這為研究外源基因表達的具體細胞部位及組織部位提供了條件，這是它的一大優(yōu)點。在實驗過程中要設(shè)定嚴格的陰性對照，GUS 活性的檢測方法有很多，包括組織化學法、色譜法、熒光法等。GUS活性檢測多采用組織化學染色法，轉(zhuǎn)化組織與對照組織相比呈可區(qū)分的藍色。GUS活性檢測是柑橘[55]轉(zhuǎn)基因植株檢測的一種常規(guī)方法，在轉(zhuǎn)基因植株鑒定中有著廣泛應(yīng)用。

32PCR技術(shù)

轉(zhuǎn)基因植物核酸水平上的檢測實質(zhì)是檢測插入的外源基因，主要的檢測方法是多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)。PCR技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種體外擴增特異性DNA片段的技術(shù)，主要有常規(guī)定性PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)（MPCR）、PCR-GeneScan、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、電化學發(fā)光PCR （ECL-PCR）、PCR-ELISA法。其中，PCR-ELISA 法能半定量檢測轉(zhuǎn)基因成分含量；qRT-PCR 能定量檢測轉(zhuǎn)基因含量，且采用閉管分析，有效消除了核酸的交叉污染，是適合植物轉(zhuǎn)基因檢測鑒定的一種快速、靈敏、準確、實用的方法。總體來說，PCR 反應(yīng)靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，常采用Southern 雜交、酶切、測序等進一步驗證其結(jié)果。PCR已成功用于柑橘轉(zhuǎn)基因植株的檢測[55]；楊東燕等[56]采用PCR技術(shù)建立了對抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進行品系鑒定的檢驗方法。

33雜交檢測

外源基因?qū)胫参锖螅D(zhuǎn)基因植株在DNA、RNA及蛋白質(zhì)水平上均與對照存在差異，這三種水平的差異可分別通過Southern雜交、Northern雜交和Western雜交得到檢測。核酸分子雜交是根據(jù)外源基因序列設(shè)計探針，將探針與待測核苷酸序列雜交，由雜交結(jié)果判斷待測基因片段是否與已知外源基因同源。核酸分子雜交檢測轉(zhuǎn)基因成分具有靈敏度高、特異性強的特點，但雜交程序復雜，對實驗技術(shù)要求較高，用于檢測所轉(zhuǎn)化植株中外源基因的整合（Southern 雜交）和表達（Northern雜交），有時也用來驗證PCR產(chǎn)物的準確性。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株都采用Southern雜交檢測基因是否整合，在柑橘、杏的轉(zhuǎn)基因檢測中得到廣泛應(yīng)用[34]。而通過Northern或Western雜交則可以檢測基因是否表達，Northern雜交于草莓中得到廣泛應(yīng)用[34]。

34免疫學檢測

免疫學檢測是蛋白質(zhì)水平的一種檢測方法，主要的方法是免疫酶聯(lián)吸附法（ELISA）。ELISA原理是利用抗原和抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。陳松等[57]和秦崇濤等[58] 研究表明雙抗夾心ELISA 法能對轉(zhuǎn)基因含量進行定量檢測?；贓LISA 法的改進方法還有試紙檢測，與常規(guī)ELISA相比，不同之處是以硝化纖維代替聚苯乙烯反應(yīng)板為固相載體，外源蛋白特異結(jié)合的抗體上聯(lián)結(jié)了顯色劑被固定在試紙條內(nèi)，檢測時只需將試紙條插入待測樣品的提取物中，就可以快速測定被測樣品中是否含有被檢測的轉(zhuǎn)基因蛋白。目前國內(nèi)已有用一張試紙檢測轉(zhuǎn)基因番茄[59]的報道。應(yīng)用ELISA 法和試紙條檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，只限于幾個種類，主要是因為有些插入的外源基因本身不表達蛋白質(zhì)或表達量很低或表達量變化很大，很容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且制備特異的酶標抗體較為復雜。

綜合目前的轉(zhuǎn)基因檢測手段，雖然檢測方法豐富，但都有其優(yōu)勢和不足。目前國內(nèi)已經(jīng)建立了大豆、油菜、玉米、蔬菜、煙草、飼料、食品等的轉(zhuǎn)基因檢測體系，但尚未建立有效的水果轉(zhuǎn)基因檢測體系，因此，完善轉(zhuǎn)基因檢測體系和建立果樹轉(zhuǎn)基因體系意義深遠。

4果樹轉(zhuǎn)基因研究存在的問題和展望

果樹轉(zhuǎn)基因雖然取得了較快的發(fā)展，但研究中還存有一些潛在問題：食品安全性問題、病蟲的抗性問題、環(huán)境生態(tài)平衡問題等。另外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面也存在一些問題：轉(zhuǎn)基因尚未能定點、定量導入受體基因組中并獲得穩(wěn)定、高效的表達和遺傳，且又不影響受體生物原有優(yōu)良性狀的表達。如：AC/DS轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的載體，其宿主范圍廣，提高了轉(zhuǎn)化效率，并能有效地將大片段DNA以完整的單拷貝方式整合到宿主染色體上。再如：利用核基質(zhì)附著區(qū)序列，將轉(zhuǎn)基因與周圍染色質(zhì)分離開來，使轉(zhuǎn)基因表達不受染色體上整合位點的影響，形成一個獨立調(diào)節(jié)的染色質(zhì)區(qū)域，這樣轉(zhuǎn)基因表達水平就會隨拷貝數(shù)增加而明顯增強。

展望果樹遺傳轉(zhuǎn)化工程，未來的研究應(yīng)集中在下列幾個方面：（1）進一步建立完善高效穩(wěn)定的果樹目的基因的轉(zhuǎn)化體系；（2）加快果樹目的基因的分離與克隆。除利用模式植物中已轉(zhuǎn)化成功的目的基因外，加快果樹本身基因的分離已成當務(wù)之急；（3）開展果樹轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；（4）加大對果樹基因工程生物安全性及生態(tài)問題的關(guān)注。

參考文獻：

[1]McGranahan H，Leslie C A，Uratsu S L，et alAgrobacterium-mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of plants[J] Nature BioTechnology，1988，6：800-804

[2]Smigocki A C，Hammerschlag F ARegeneration of plants from peach embryo cells infected with a shooty mutant strain of Agrobacterium[J] J Amer Soc Hort Sci，1991，116：1092-1097

[3]Pérez-Clemente R M，Pérez-Sanjuan A， Garcia-Férriz L， et al Transgenic peach plants （Prunus persica L） produced by genetic transformation of embryo sections using the green fluorescent protein（GFP） as an in vivo marker[J]Molecular Breeding， 2004，14：419-427

[4]Padilla I M G，Golis A，Gentile A， et al Evaluation of transformation in peach Prunus persica explants using green fluorescent protein（GFP） and beta-glucuronidase（GUS） reporter genes[J]Plant Cell Tissue and Culture， 2006， 84：309-314

[5]劉祥林，湯浩茹.桃胚培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（6）：1087-1089.

[6]Ye X J， Brown S K， Scorza R， et al Genetic transformation of peach tissues by particel bombardment[J] J Amer Soc Hort Sci， 1994， 119：367-373

[7]萬春雁，韓明玉，趙彩平，等.桃花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)的初步研究[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（5）：38-42.

[8]Smigocki A C， Owins L D， Hammerschlag F A In vitro transformation of peach， Prunus persica （L） Batsch—using Agrobacterium tumefaciens[J] HortScience，1987，22：1069

[9]Martin G C， Miller A N， Castle L A， et al Feasibility studies using beta-glucuronidase as a gene fusion marker in apple，peach and radish[J]J Amer Soc Hort Sci， 1990， 115（4）：686-691

[10]Ognjanow V， Vujanic V D， Macet K， et al Tissue culture approaches to peach improvement[A]Progress in temperate fruit breeding[C] Wadenswil-Einsiedeln：Proceeding of the Eucarpia Fruit Breeding Section Meeting，1994， 389-393

[11]Hammerschlag F A，Owens L D，Smigocki A CAgrobacterium-mediated transformation of peach cells derived from mature plants that were propagated in vitro[J] J Amer Soc Hort Sci， 1989， 114（3）：508-510

[12]金勇豐，張耀洲，陳大明，等.桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表達載體的構(gòu)建[J].園藝學報，1998，25（1）：37-43.

[13]金勇豐，張耀洲.桃果實ACC合酶cDNA的克隆[J].園藝學報，2000，27（4）：257-262.

[14]李曜東，魏玉凝.肥城桃組培苗誘導、基因轉(zhuǎn)化及其增殖[J].果樹學報，2003，20（1）：70-72.

[15]吳延軍，張上隆，徐昌杰，等.根癌農(nóng)桿菌介導的桃幼胚轉(zhuǎn)化實驗參數(shù)研究[J].果樹學報，2004，21（5）：477-479.

[16]Mante S， Morgens P H， Scorza R， et al Agrobacterium-mediated transformation of plum （Prunus domestica L） hypocotyl slices and regeneration of transgenic plants[J] Nature Biotechnology，1991， 9：853-857

[17]Scorza R， Cordts J M， Mante S， et al Agrobacterium-mediated transformation of plum with the papaya ringspot virus coat protein gene[J] HortScience， 1991， 26（6）：786

[18]Scorza R， Levy L， Damsteegt V， et al Transformation of plum with the papaya ringspot virus coat protein gene and reaction of transgenic plants to plum pox virus[J] J Amer Soc Hort Sci， 1995， 120（6）：943-952

[19]Scorza R， Ravelonandro M， Callaban A M， et al Transgenic plums（Prunus domestica L） express the plum pox virus coat protein gene[J] Plant Cell Rep， 1994，14：18-22

[20]Ravelonandro M， Monsion M， Teycheney P Y， et al Construction of a chimeric viral gene expressing plum pox virus coat protein[J] Gene， 1992， 120：167-173

[21]Ravelonandro M， Monsion M， Delbos R， et al Variable resistance to plum pox virus and potato virus Y infection in transgenic plants expressing plum pox virus coat protein[J] Plant Science， 1993， 91：157-169

[22]Ravelonandro M， Scorza R， Bachelier J C， et al Resistance of transgenic Prunus domestica to plum pox virus infection[J] Plant Disease， 1997， 81：1231-1235

[23]Ravelonandro M， Scorza R， Minoiu N Field tests of transgenic plums in Romania[J] Plant’s Health， 2002， （Spec ed）： 16-18

[24]Yancheva S D， Druart P H， Watillon B Agrobacterium-mediated transformation of plum （Prunus domestica L）[J] Acta Hort， 2002， 577：215-217

[25]Malinowski T， Cambra M， Capote N， et al Field trials of plum clones transformed with the plum pox virus coat protein （PPV-CP） gene[J] Plant Disease， 2006， 90：1012-1018

[26]Urtubia C， Devia J， Castro A， et al Agrobacterium-mediated genetic transformation of Prunus salicina[J] Plant Cell Rep， 2008， 27：1333-1340

[27]Ilardi V， Nicola-Negri E D Genetically engineered resistance to plum pox virus infection in herbaceous and stone fruit hosts[J] GM Crops， 2011， 2：1，24-33

[28]da Cmara Machado M L， da Cmara Machado A， Hanzer V， et a1 Regeneration of transgenic plants of Prunus armeniaca containing the coat protein gene of plum pox virus[J] Plant Cell Rep， 1992， 11：25-29

[29]da Cmara Machado A， Katinger H，da Cmara Machado M L Coat protein-mediated protection against plum pox virus in herbaceous model plants and transformation of apricot and plum[J] Euphytica， 1994， 77：129-l34

[30]Petri C， Alburquerque N， Garcia-Castillo S， et a1 Factors affecting gene transfer efficiency to apricot leaves during early Agrobacterium-mediated transformation steps[J] J Hortic Sci Biotech， 2004， 79：704-712

[31]Petri C， Alburquerque N， Burgos L The effect of aminoglycoside antibiotics on the adventitious regeneration from apricot leaves and selection of nptⅡ-transformed leaf tissues [J] Plant Cell Tiss Organ Cult， 2005， 80：271-276

[32]Petri C， Alburquerque N， Perez-Tornero O， et a1 Auxin pulses and a synergistic interaction between polyamines and ethylene inhibitors improve adventitious regeneration from apricot leaves and Agrobacterium-mediated transformation of leaf tissues[J] Plant Cell Tissue Organ Cult， 2005， 82：105-111

[33]Quemada H L， Hostis B， Gonsalves D， et al The nucleotide sequence of the 3′-terminal regions of papaya ringspot virus strains W and P[J] J Gen Virol， 1990， 71：203-210

[34]宮雪超，于麗杰，高金秋.轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定[J].牡丹江師范學院學報，2007，1：15-17.

[35]Archilleti T， Lauri P， Damiano C Agrobacterium-mediated transformation of almond leaf pieces[J] Plant Cell Rep， 1995， 14：267-272

[36]Miguel C M， Oliverian M M Transgenic almond plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of leaf explants[J] Plant Cell Rep， 1999， 18：387-393

[37]Ainsley P J Developing tissue culture and genetic transformation techniques for almond（Prunus dulcis Mill）[D] Aelaide University， 2000

[38]Ramesh S A， Kaiser B N， Franks T， et al Improved methods in Agrobacterium-mediated transformation of almond using positive （mannose/pmi） or negative （kanamycin resistance） selection-based protocols[J] Plant Cell Rep， 2006， 25：821-828

[39]Negri P E， Magnanini L， Cantoni G， et al Piante arboree transgeniche： Prime esperienze sul transferimento di geni per il controllo dell’habitus vegetativo[J] Rivista di Frutticoltura， 1998，60（5）：91-97

[40]方宏筠，王關(guān)林，王火旭，等.抗菌肽基因轉(zhuǎn)化櫻桃矮化砧木獲得抗根瘤病的轉(zhuǎn)基因植株[J].植物學報，1999，41（11）：1192-1198.

[41]Bhagwat B， Lane W D In vitro shoot regeneration from leaves of sweet cherry （Prunus avium） ‘Lapins’ and ‘Sweetheart’ [J] Plant Cell Tissue Organ Cult， 2004，78：173-181

[42]Song G Q， Sink K C Optimizing shoot regeneration and transient expression factors for Agrobacterium tumefaciens transformation of sour cherry （Prunus cerasus L） cultivar Montmorency[J] Scientia Hortic， 2005， 106（1）：60-69

[43]Zhang K C， Zhang J K Cloning and sequencing of PGIP gene from Prunus mahaleb L[J] Journal of Agricultural Biotechnology， 2000， 8（3）：281-283

[44]Dolgov S VGenetic transformation of sour cherry （Cerasus vulgaris Mill）[A]In：Bajaj Y P S（ed）Biotechnology in Agriculturel and Forestry，Vol44，Transgenic trees[M]Heidelberg：Springer-Verlag Berlin，1999，29-38

[45]Dolgov S V，F(xiàn)irsov A PRegeneration and genetic transformation of sour cherry leaf dises[J]Acta Hortic，1999，484：577-580

[46]Brasileiro A C， Leple J C， Muzzin J， et al An alternative approach for gene transfer in trees using wild type Agrobacterium strains[J] Plantmol Biol， 1991， 17（3）：441-452

[47]da Cmara M A，da Cmara Machado M L Genetic transformation in Prunus armeniaca L[A] In：Bajaj Y P （ed）Biotechnology in Agriculturel and Forestry，Vol34 Plant protoplasts and genetic engineering VI[M] Berlin：Springer-Verlag， 1995， 240-254

[48]Druart P， Delporte F， Brazda M， et al Genetic transformation of cherry trees[J] Acta Hort， 1998， 468： 71-76

[49]楊奇志，趙琦.基因槍技術(shù)在農(nóng)作物基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用和進展[J].生物技術(shù)通報，2003，6：14-17，23.

[50]Vardi A， Beichman S， Aviv D Genetic transformation of citrus protoplasts and regeneration of transgenic plants[J]Plant Science， 1990， 69：199-206

[51]Oliveira M M， Miguel C M， Raquel M H Transformation studies in woody fruit species[J] Plant Tissue Culture and Biotechnology， 1996， 2（2）：76-93

[52]趙慧，宋桂英.將菜豆幾丁酶基因?qū)胩O果砧木的研究[J].激光生物學報，1998，7（3）：163-167.

[53]Soloki M， Alderson P G， Fucker G Genetic transformation grape using Agrobacterium biolistics and silicon carbide[A] In：Davey M R， Alderson P G， Lowe K C， et al Tree biotechnology [C]Nottingham： Nottingham University Press，1998， 325-330

[54]Gresbach R T A method for transforming whole plants via the eletrophoreses of shoot tips[J] HortScience， 1995， 30 （4）：788

[55]蔣迪，徐昌杰，陳大明，等.柑橘轉(zhuǎn)基因研究的現(xiàn)狀及展望[J].果樹學報，2002，19（1）：48-52.

[56]楊冬燕，楊永存，鄧平建.抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1的PCR檢測[J].中國公共衛(wèi)生，2007，1：91-92.

[57]Chen S， Wu J Y， Chen D R， et alStudy on the enzyme-linked immunosorbent assay of Bacillus thuringiensis insecticidal protein expressed in transgenic cotton[J] Acta Gossypii Sinica，1999， 11（5）： 258-267

[58]秦崇濤，陳在杰，蘇軍，等.3 種ELISA 法定量檢測Cry1A（c）蛋白的比較研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2003，18（4）：258-263.

[59]一張試紙測定轉(zhuǎn)基因番茄[J].長江蔬菜，2004，2：50.