超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘋果和土壤中乙嘧酚殘留量

摘要：建立了蘋果和土壤中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)乙嘧酚殘留方法，考察了基質(zhì)效應(yīng)，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)。蘋果和土壤經(jīng)乙腈振蕩提取后，用MCX柱凈化，采用UPLC-MS/MS正離子掃描分析乙嘧酚。以蘋果和土壤為基質(zhì)進(jìn)行3檔添加水平和5 次重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明添加濃度為001、005、01 mg/kg的平均回收率為88%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為21%～87%。本方法在蘋果和土壤中的檢出限為2 μg/kg，定量限為4 μg/kg，在10～300 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系好（r>0999）。

關(guān)鍵詞：乙嘧酚；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；殘留；蘋果；土壤

中圖分類號(hào)：O657.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0101-05

目前國內(nèi)有關(guān)乙嘧酚殘留的分析研究較少，多集中于其在黃瓜中的殘留分析，已知其在黃瓜中的最大殘留限量值是1 mol/L[6]，尚未制定出蘋果中乙嘧酚的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。劉康云等（2008）[7]采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法分析了乙嘧酚在黃瓜中的殘留量。王蒙岑等（2009）[8]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器建立了乙嘧酚在黃瓜和土壤中的殘留檢測(cè)方法，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769檢測(cè)乙嘧酚，回收率低，且難以達(dá)到較低的限量要求。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以提高目標(biāo)物質(zhì)的靈敏度和回收率，縮短進(jìn)樣時(shí)間，提高檢測(cè)效率。張文童等（2012）[9]研究用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜、草莓中乙嘧酚。Pizzutti等（2009）[10]報(bào)道了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析葡萄等 6 種農(nóng)作物中包括乙嘧酚的171 種農(nóng)藥殘留。

本研究采用Waters的MCX離子柱進(jìn)行前處理，大大純化了樣品，通過優(yōu)化液相色譜條件，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC -MS/MS），建立了乙嘧酚的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1材料與方法

2結(jié)果與討論21前處理?xiàng)l件優(yōu)化

為方便快捷提取分離乙嘧酚，取分別添加了01、05、10 mg/kg乙嘧酚的空白蘋果樣品，用乙腈進(jìn)行粗提取后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)近干，加入2 ml甲醇定容，022 μm濾膜過濾，上液相色譜紫外光譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這種方法基本上可以將乙嘧酚和雜質(zhì)峰分開，但是雜質(zhì)含量非常高，而且乙嘧酚峰會(huì)發(fā)生漂移，最大可漂移2 min左右。為解決這個(gè)問題，對(duì)粗提取液進(jìn)行凈化處理。

考察Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱及調(diào)節(jié)乙腈提取液酸堿度的方法。取3份添加了05 mg/kg乙嘧酚的空白蘋果樣品，用乙腈進(jìn)行粗提取后，前2份粗提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)近干，之后分別過Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱；另外一份加入10 ml乙腈，先用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4～5，萃取分層取水層，再用弱堿調(diào)節(jié)pH值為9～10，用乙腈萃取，旋轉(zhuǎn)蒸干，用2 ml甲醇定容，022 μm濾膜過濾，上機(jī)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用Waters Sep-pak C18固相萃取小柱進(jìn)行前處理的樣品回收率只有186%，調(diào)節(jié)乙腈提取液酸堿度的方法回收率可以達(dá)到786%，而Waters Oasis MCX固相萃取小柱的回收率能達(dá)到958%。很顯然用Waters Oasis MCX固相萃取小柱前處理的方法提取分離的效果最好。

乙嘧酚的結(jié)構(gòu)含有堿性基團(tuán)氨基，而羥基在這個(gè)結(jié)構(gòu)中不具有酸性，所以該化合物為堿性化合物，而且化合物中含有極性基團(tuán)羥基及氨基使其極性較大，Waters Sep-pak C18固相萃取小柱不足以使乙嘧酚吸附在小柱上；試驗(yàn)也證明，提取液通過小柱時(shí)，收集提取液，過膜上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有大量的乙嘧酚。

調(diào)節(jié)乙腈提取液酸堿度的方法和Waters Oasis MCX固相萃取小柱都能純化分離乙嘧酚，但是調(diào)節(jié)pH值的方法繁瑣，工作量大，效率低；Waters Oasis MCX固相萃取小柱和調(diào)節(jié)pH值的方法原理相同，但是Waters Oasis MCX固相萃取小柱更方便、更快捷，回收率好，且乙嘧酚峰不會(huì)發(fā)生漂移，所以選擇Waters Oasis MCX固相萃取小柱分離純化前處理。

22色譜條件優(yōu)化

乙嘧酚的測(cè)定方法通常是以高效液相色譜為基礎(chǔ)的紫外法。紫外法干擾峰很多，尤其對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，很難滿足較為嚴(yán)格的限量要求。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定乙嘧酚殘留具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢(shì)。

乙嘧酚在C18柱上保留性差，流動(dòng)相中的極性溶劑含量比較高。比較了甲醇體系和乙腈體系，發(fā)現(xiàn)甲醇體系下乙嘧酚是乙腈體系下的10倍。通過試驗(yàn)確定流動(dòng)相為甲醇和01%甲酸溶液，采用梯度洗脫程序，既能保證乙嘧酚的靈敏度，又能保證其較好的峰型。

23質(zhì)譜條件優(yōu)化

選擇乙嘧酚的加合離子峰為母離子，主要有[M+H]+，在流動(dòng)相存在的條件下進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。當(dāng)流動(dòng)相為01%甲酸和乙腈時(shí)，[M+H]+靈敏度低；當(dāng)流動(dòng)相為01%甲酸和甲醇時(shí)，[M+H]+靈敏度高。同時(shí)對(duì)質(zhì)譜的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、脫溶劑氣和錐孔氣流量進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了質(zhì)譜條件。再對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，從而確定子離子及碰撞能量。

乙嘧酚含有氨基集團(tuán)，具有堿性，易結(jié)合氫根變成氨基正離子，因此這種化合物可采用ESI+模式掃描測(cè)定。通過母離子掃描（MS Scan），可獲得一級(jí)質(zhì)譜圖，見圖1，兩種化合物的軟電離均以準(zhǔn)分子離子峰[M+H]形式存在。