水產(chǎn)品中氯霉素藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

摘 要：氯霉素類藥物是一類作用性強(qiáng)、抗菌廣譜的抗生素，但其在水產(chǎn)品中的殘留對(duì)人類健康所造成的危害日益引起人們的重視，加強(qiáng)對(duì)抗生素使用、殘留檢測(cè)研究勢(shì)在必行。該文對(duì)氯霉素殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：氯霉素；檢測(cè)方法；殘留；液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類號(hào) X954 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）01-02-111-03

氯霉素 （chloramphenicol，CAP） 是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌都有較強(qiáng)的抑制作用，作為藥物常用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病的治療和預(yù)防[1]。由于氯霉素對(duì)人的造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒副作用，歐盟、美國(guó)在有關(guān)法規(guī)中均規(guī)定在動(dòng)物源食品中不得檢出[2-4]，我國(guó)也2002年將氯霉素列為禁用獸藥（農(nóng)業(yè)部208號(hào)公告） [5-6]。在農(nóng)業(yè)部的組織下，我國(guó)連續(xù)5a對(duì)全國(guó)20個(gè)省市自治區(qū)的大型養(yǎng)殖漁場(chǎng)實(shí)施了包括氯霉素在內(nèi)的禁用漁用藥物殘留監(jiān)控、監(jiān)測(cè)計(jì)劃[7]。為此本文對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素藥物殘留的檢測(cè)方法進(jìn)行了分析研究。

氯霉素殘留分析方法的建立始于20世紀(jì)70、80年代，氯霉素藥物殘留檢測(cè)方法很多，主要有微生物測(cè)定法、化學(xué)分析法和免疫分析法等。

1 微生物測(cè)定法

微生物法是測(cè)定抗生素類藥物常用的方法，主要是利用樣品中的抗生素殘留能對(duì)培養(yǎng)基中的細(xì)菌產(chǎn)生抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的有無(wú)及大小來(lái)判定結(jié)果，采用不同的菌株，可以檢測(cè)不同的抗生素殘留。目前常用的微生物檢測(cè)方法有紙片法和杯碟法等，此法簡(jiǎn)單、費(fèi)用少、速度快。但特異性差，易受其它抗生素影響且靈敏度不高，檢出限較高，可用于高殘留大量樣品的篩選。

2 化學(xué)分析法

目前，水產(chǎn)品中氯霉素殘留的常用的化學(xué)分析方法主要有紫外光譜分析、熒光分析、氣相色譜法、液相色譜法、氣質(zhì)連用法、液相質(zhì)譜聯(lián)用法。在獸藥檢測(cè)中最常用的方法是色譜法，檢測(cè)靈敏度較高，檢出限低，應(yīng)用廣泛。

2.1 氣相色譜分析法 氣相色譜法的特點(diǎn)是分離效能高，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，檢出限低，常用于抗生素藥物殘留的檢測(cè)，但一般前處理都需要進(jìn)行衍生化，處理過(guò)程比較繁雜。

劉永濤[8]等以尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）和南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）為實(shí)驗(yàn)材料，建立了測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留量的毛細(xì)管電子捕獲氣相色譜法。本方法氯霉素在1.0～500.0μg/L濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r≥0.9983，加標(biāo)水平在0.2～10.0μg/kg時(shí)，回收率為83.30%～101.22%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36% ～12.57%。

趙文亞[9]等用乙酸乙酯提取，正己烷去脂肪，過(guò)Sep-C18柱進(jìn)行凈化，用BSTFA-TMCS衍生后進(jìn)帶有微電子俘獲器的氣相色譜儀檢測(cè)。該方法的線性范圍為0.5～500μg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999，最低檢測(cè)限為0.1μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～11.0%，靈敏度較高。

2.2 液相色譜分析法 HPLC法是繼氣相色譜法之后，20 世紀(jì) 70 年代初期發(fā)展起來(lái)的一種以液體作流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。高效液相色譜適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于藥物殘留的分析檢測(cè)。

陳家華[10]建立了快速、靈敏的高效液相色譜方法測(cè)定家禽中的氯霉素。家禽組織中氯霉素先用乙酸乙醋抽提，然后用0.5mol/L高氯酸溶液凈化提取溶液，用紫外350nm波長(zhǎng)的高效液相色譜儀測(cè)定氯霉素，該方法檢出限7.3μg/kg，回收率為92.5%。蔣定國(guó)[11]建立了高效液相色譜分析方法，靈敏、快速的測(cè)定牛奶中氯霉素的殘留，最低檢出濃度為1.1μg/kg，氯霉素濃度在20～100μg/kg范圍內(nèi)，該方法平均回收率為88.0%～97.7%，RSD為5.3%～6.4%。黃志勇[12]等建立了高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)養(yǎng)殖水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的方法，采用乙酸乙酯提取樣品中的殘留氯霉素，經(jīng)凈化和濃縮處理，以甲醇-水（35∶[KG-*3]65，V/V）為流動(dòng)相，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，該方法的檢出限為0.014μg/g，平均加標(biāo)回收率為93.2%，精密度（RSD）小于5%。

2.3 氣質(zhì)聯(lián)用分析法 氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法是將GC和MS 通過(guò)接口連接起來(lái)，GC將復(fù)雜混合物分離成單組分進(jìn)入MS后進(jìn)行分析檢測(cè)。將GC和MS聯(lián)用，揚(yáng)長(zhǎng)避短，具有高分辨能力、高靈敏度和分析過(guò)程簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，GC-MS在醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)藥和興奮劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

劉宜孜[13]等利用固相萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析蜂蜜中的氯霉素殘留量。對(duì)氯霉素在固相萃取柱上的保留行為進(jìn)行了研究，優(yōu)化固相萃取條件，發(fā)現(xiàn)不同濃度的氯霉素在硅膠柱和C18柱上的回收率均在90%以上，蜂蜜加標(biāo)的回收率為80%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.2%～18.2%，最低檢出限為0.1μg/kg。

謝孟峽[14]等對(duì)雞肉、豬肉、豬肝、鴨肝等動(dòng)物組織樣品中的氯霉素殘留的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。用乙酸乙酯和磷酸鹽緩沖溶液提取動(dòng)物組織中的氯霉素殘留，用硅膠和C18固相萃取柱對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行凈化和富集。該方法對(duì)不同基體樣品的加標(biāo)回收率為80% ～100%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%；該方法的檢出限為0.1μg/kg。

李鵬[15]等用乙酸乙酯提取，正己烷分配去脂肪，再用Florisil柱進(jìn)一步凈化，甲苯作為反應(yīng)介質(zhì)，用N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）-三甲基氯硅烷（TMCS）（體積比為99∶[KG-*3]1）進(jìn)行硅烷化處理，用間硝基氯霉素（m-CAP）作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。該方法前處理步驟簡(jiǎn)單，處理后雜質(zhì)干擾少，靈敏度高，適用性強(qiáng)，可用于豬肉及禽類、水產(chǎn)品等多種動(dòng)物組織中氯霉素類藥物殘留的檢測(cè)。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用分析法 近年來(lái)，隨著液質(zhì)的普遍應(yīng)用，其靈敏度高，能夠方便地對(duì)藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)構(gòu)確證，是美國(guó)FDA推薦使用的檢測(cè)氯霉素的確證方法。

彭濤[16]等用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）同時(shí)測(cè)定蝦中的氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟甲砜霉素（FF） 。檢出限為0.01 ng/g。在添加濃度0.1～2.0 ng/g范圍內(nèi)，氯霉素回收率為73.9%～96.0%。

謝文[17]等建立了動(dòng)物源產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康母咝б合嗌V-電噴霧電離三級(jí)四極桿質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）的方法，采用負(fù)離子，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)氯霉素4對(duì)離子（321.0/151.9，321.0/256.6，321.0/194.2，321.0/175.4）。該方法線性范圍為0.1～1.6μg/kg；對(duì)不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率為80%～112.5%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%；該方法的測(cè)定低限為0.1μg/kg。

周萍[18]等利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)蜂膠中的氯霉素殘留進(jìn)行測(cè)定，采用10%高氯酸提取，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH至10.5，并用乙酸乙酯進(jìn)行反萃取，從而凈化樣品，本方法檢測(cè)限為 0.1μg/kg。

田艷玲[19]等建立用乙腈提取牛奶樣品，以MGⅢ-C18柱（2.1mm×150 mm，1.8 μm）分離，流動(dòng)相為水溶液和乙腈（體積比為65：35），電噴霧負(fù)離子MRM模式檢測(cè)方法。該方法的檢出限為0.07 μg/L，線性范圍0.05～20.0 μg/L，加標(biāo)回收率98.5%～10.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.57 %。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀法測(cè)定氯霉素藥物殘留，能夠消除假陽(yáng)性，穩(wěn)定性好，選擇性好，靈敏度高，檢出限低，能夠達(dá)到歐盟和日本等國(guó)家對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品最高殘留量的要求。

3 免疫分析法

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。目前ELISA方法已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。

張勝幫[20]等采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA） 測(cè)定魚(yú)、蝦類水產(chǎn)品中殘留氯霉素含量，結(jié)果表明：檢出限為0.009 ng/mL，變異系數(shù)為 3.0%，樣品測(cè)定的相對(duì)偏差為 3.4%～7.1%，回收率為92.5%～102.0%。在 0.025～2.00 ng/mL 測(cè)定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) R=0.9993。劉堃[21]等利用酶聯(lián)免疫法了檢測(cè)深圳市市售蜂蜜中氯霉素的殘留量，以掌握蜂蜜中氯霉素污染的情況。宋巍巍[22]等利用免疫傳感法測(cè)定氯霉素，該方法檢測(cè)CAP的檢出限為0.064μg/L；檢測(cè)線性范圍為0.15～600μg/L，測(cè)試牛奶樣品的平均回收率為89.8%。免疫電化學(xué)傳感器體積較小，便于攜帶，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)牛乳樣品中氯霉素殘留的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫法的缺點(diǎn)在于影響因素較多，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，抗體批次不同，測(cè)定結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)差異等[23]，但是由于ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，更適合現(xiàn)場(chǎng)篩查陽(yáng)性樣品。

4 問(wèn)題和展望

色譜法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，是目前現(xiàn)階段普遍采用的方法之一，但是前處理比較復(fù)雜，前處理試劑幾乎都是有機(jī)試劑，容易污染環(huán)境和對(duì)人體造成傷害，在儀器上檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；質(zhì)譜法能夠用于確證性分析，靈敏度高，檢出限低，滿足檢測(cè)要求，是未來(lái)氯霉素殘留檢測(cè)和確證方法的發(fā)展趨勢(shì)。酶聯(lián)免疫試劑盒的研制隨著技術(shù)的提高，能夠短短幾個(gè)小時(shí)檢測(cè)上百個(gè)樣品，大大提高檢測(cè)效率和滿足多樣品的同時(shí)檢測(cè)。它在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層檢測(cè)中應(yīng)用前景廣闊，能夠大量篩選陽(yáng)性樣品。因此，對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素殘留的檢測(cè)，可采取ELISA試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行初篩，對(duì)陽(yáng)性樣品用GC/MS或 LC/MS/MS進(jìn)行確證，以消除假陽(yáng)性帶來(lái)的誤差。

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（責(zé)編：施婷婷）