“小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力比較”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)與探討

摘 要：對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)“小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較”進(jìn)行了合理的改進(jìn)，簡化實(shí)驗(yàn)操作，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)指出實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意的若干問題，保證實(shí)驗(yàn)順利完成。

關(guān)鍵詞：小麥萌發(fā)；淀粉酶；活力；實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

中圖分類號(hào) S5121 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）03-29-02

新陳代謝是生命的基本特征之一，一切生物的生命都靠新陳代謝的正常運(yùn)轉(zhuǎn)來維持[1]。酶是維持生物新陳代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑，在生物體內(nèi)起重要作用。新陳代謝是生物化學(xué)課程的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容，“小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較”實(shí)驗(yàn)是普通高校生物學(xué)及相關(guān)專業(yè)生物化學(xué)課程新陳代謝部分的實(shí)驗(yàn)[2]。該實(shí)驗(yàn)對(duì)萌發(fā)前后小麥淀粉酶進(jìn)行提取，然后用分光光度法測定提取液淀粉酶的活力，并對(duì)萌發(fā)前后小麥淀粉酶的活力進(jìn)行比較，以了解生物在新陳代謝過程中酶活力的變化。該實(shí)驗(yàn)既有定性提取又有定量活力測定，而且實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與人們生活密切相關(guān)，能引起學(xué)生的興趣。雖然實(shí)驗(yàn)操作不難，但實(shí)驗(yàn)材料有萌發(fā)前后兩種小麥種子，實(shí)驗(yàn)操作既有酶的提取，又有酶活力的測定，活力測定時(shí)除了實(shí)驗(yàn)材料管外，還有標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，很多學(xué)生不能在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，影響學(xué)生的積極性和實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。為此，筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)操作做了一些合適、必要的改進(jìn)，簡化了實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，并總結(jié)出實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)該注意的問題，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)原理

小麥種子中貯藏的糖類主要以淀粉的形式存在，小麥種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的淀粉酶能使淀粉分解為麥芽糖。麥芽糖具有還原性，能與3， 5-二硝基水楊酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸，用分光光度計(jì)測量吸光度，吸光度的數(shù)值與麥芽糖的濃度成正比，用吸光度和標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖濃度計(jì)算出提取液的麥芽糖濃度，最終計(jì)算出樣品的淀粉酶活力。

2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

小麥種子購于安徽省黃山市種子站。麥芽糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、氯化鈉、3，5-二硝基水楊酸等均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水。

UV754N紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），榮華800-1離心機(jī)（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），HH-1杰瑞爾數(shù)顯水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

3 原實(shí)驗(yàn)操作和酶活力計(jì)算

31 原實(shí)驗(yàn)操作 小麥種子浸泡25h后，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。分別取15顆干燥和發(fā)芽第4天的小麥種子，加200mg海砂和10mL 1%氯化鈉溶液，在乳缽內(nèi)用力磨碎。室溫靜置提取20min，中間攪拌幾次。將提取液離心（1500r/min）6～7min，將上清液倒入量筒，測定酶提取液的總體積。進(jìn)行酶活力測定時(shí)，用磷酸緩沖液將酶提取液稀釋10倍。然后按照實(shí)驗(yàn)教材用分光光度法測定麥芽糖濃度，并計(jì)算出酶的活力。

32 原酶活力計(jì)算 原酶活力計(jì)算公式為：總活力單位=c酶×n酶×V酶，其中c酶為酶液中麥芽糖的濃度，n酶為酶液稀釋倍數(shù)，V酶為提取酶液的體積。

4 改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作和酶活力計(jì)算

41 改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作 小麥種子浸泡25h后，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。分別取15顆干燥和發(fā)芽第4天的小麥種子，加200mg海砂和15mL 1%氯化鈉溶液，在乳缽內(nèi)用力磨碎。室溫靜置提取20min，中間攪拌幾次。將提取液離心（1 500r/min）6～7 min，將上清液倒入100mL容量瓶，用磷酸緩沖液稀釋和定容。進(jìn)行酶活力測定時(shí)，直接取一定體積的定容液用分光光度法測定麥芽糖濃度，并計(jì)算出酶的活力。

42 改進(jìn)的酶活力計(jì)算 實(shí)驗(yàn)操作修改后酶活力計(jì)算公式也要進(jìn)行相應(yīng)的修改，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后的酶活力計(jì)算公式簡化為：總活力單位=c酶×100，其中c酶為提取液中麥芽糖的濃度，100為酶提取液的總體積。

5 效果評(píng)價(jià)

小麥種子粉碎及酶提取液轉(zhuǎn)移、離心等實(shí)驗(yàn)操作均會(huì)造成提取液損失，帶來一定的實(shí)驗(yàn)誤差。將1%氯化鈉的體積由10mL增加到15mL，可以減少實(shí)驗(yàn)誤差、增強(qiáng)提取效果。實(shí)驗(yàn)改進(jìn)前，提取液最終總體積的確定經(jīng)過了量筒測量和稀釋兩步驟；該操作中用量筒測量提取液體積誤差較大，而且將提取液稀釋10倍又進(jìn)一步將誤差放大，這些都會(huì)影響到最后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作，將量筒測量體積和稀釋兩步驟簡化為用容量瓶定容一個(gè)步驟，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。而且用容量瓶定容體積比用量筒測量體積精確，最后測得的酶活力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)必然更準(zhǔn)確。因此，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)既簡化實(shí)驗(yàn)操作、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間又減少實(shí)驗(yàn)誤差、提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。與原酶活力計(jì)算公式相比，改進(jìn)后的酶活力計(jì)算公式更簡捷，計(jì)算更方便，更易于被學(xué)生理解和接受。

6 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題

（1）萌發(fā)小麥種子只需要種子部位，要棄去萌發(fā)的小葉子和嫩莖。否則將葉綠素帶入提取液，會(huì)影響后面吸光度的測量。（2）將乳缽內(nèi)的提取液轉(zhuǎn)入離心管后，要用少量1%氯化鈉溶液潤洗乳缽2次，并將潤洗液一起并入離心管。（3）為了防止酶活性降低或失活，如果室溫較高，提取時(shí)最好將乳缽放在冰水中降溫；酶提取液離心后應(yīng)立即用磷酸緩沖液稀釋定容和進(jìn)行酶活力測定。（4）教材規(guī)定的酶活力單位反應(yīng)溫度為25℃，酶活力測定時(shí)所加的各種試劑均要在25℃預(yù)熱10min。（5）將酶提取液與1%淀粉反應(yīng)3min后立即將試管放入沸水浴中使酶失活。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)將水浴鍋提前加熱到100℃。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭集，陳鈞輝 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）[M]北京：高等教育出版社，2008

[2]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第二版）[M]北京：高等教育出版社，2002

（責(zé)編：陶學(xué)軍）