桂花幼胚的離體培養(yǎng)及生根誘導(dǎo)

摘 要：對(duì)3個(gè)桂花品種大花金桂、籽銀桂、籽丹桂進(jìn)行幼胚的離體培養(yǎng)，研究了不同消毒時(shí)間、基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)離體幼胚萌發(fā)的影響，以及不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方對(duì)萌發(fā)苗生根的影響。結(jié)果表明，適合幼胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基，大花金桂為：B5+1 mg/L 6-BA+3 mg/L GA；籽銀桂：B5+2 mg/L 6-BA+2 mg/L GA ；籽丹桂：B5+1.5 mg/L 6-BA+1 mg/L GA 。生根適宜培養(yǎng)基為：1/2 MS+2 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：桂花；幼胚；離體培養(yǎng)；萌發(fā)；生根

中圖分類號(hào)：S685.130.4+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）03-0007-04

桂花 （Osmanthus fragrans）是中國十大傳統(tǒng)名花，其花期正值我國傳統(tǒng)佳節(jié)中秋節(jié)，花時(shí)香聞數(shù)里，有“獨(dú)占三秋壓群芳”之譽(yù)，在庭院綠化和香料生產(chǎn)中一直保持著重要的地位和影響。

桂花在我國的栽培歷史悠久，形成了豐富的品種和類型。大致分為金桂、銀桂、丹桂和四季桂4個(gè)品種群，157個(gè)品種[1～2]。

桂花種子有后熟作用[7，8]，采收后需要在濕潤條件下保存到第2年才能萌發(fā)，在貯藏的過程中腐爛率高達(dá)50% 以上，成為桂花育種的限制因素之一。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以促進(jìn)桂花幼胚的提前萌發(fā)，但目前研究較少[6，10]，萌發(fā)率相對(duì)較低。試驗(yàn)針對(duì)不同桂花品種的幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，促使幼胚提前萌發(fā)并提高萌發(fā)率，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量無菌試管苗，為桂花再生體系的建立奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法 1.1 材料及外植體處理

試驗(yàn)材料：取自武漢生長健壯的成年喬木桂花植株。桂花品種：大花金桂、籽銀桂、籽丹桂。

2011年3月初取未完全成熟的桂花果實(shí)。去除肉質(zhì)的外果皮、中果皮，用自來水沖洗1～2 h，在超凈工作臺(tái)上剝除內(nèi)果皮，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水漂洗3次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中消毒，消毒時(shí)間分別為 3、5、6、8、10 min，無菌水漂洗3～5次，剝?nèi)∮着呓臃N到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。1.2 幼胚萌發(fā)培養(yǎng)

幼胚萌發(fā)培養(yǎng)基：MS及B5培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA及GA。每瓶接種幼胚5個(gè)，3瓶為1個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。觀察幼胚萌發(fā)的動(dòng)態(tài)變化，35天時(shí)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，進(jìn)行長勢分析。

1.3 生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)離體幼胚萌發(fā)的影響

以B5作為基本培養(yǎng)基，配合不同濃度的6-BA和GA進(jìn)行2因素4水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共12種組合（表1），篩選大花金桂、籽銀桂、籽丹桂幼胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基。分別在40天時(shí)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率并觀察長勢。

1.4 生根培養(yǎng)

待萌發(fā)的幼苗長出2～3對(duì)真葉時(shí)進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MS，設(shè)置不同濃度NAA。每個(gè)組合接種6瓶，每瓶3個(gè)材料。

1.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基pH=5.8，6 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖。培養(yǎng)溫度25℃，光照14 h/d，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

預(yù)試驗(yàn)過程中，將幼胚接種在3 mg/L 6-BA的B5培養(yǎng)基上，設(shè)計(jì)了5個(gè)消毒時(shí)間梯度， 30天時(shí)統(tǒng)計(jì)幼胚萌發(fā)率、褐化率和污染率。結(jié)果（表2）表明，0.1%升汞消毒大于3 min，即可達(dá)到良好的消毒效果，消毒時(shí)間過長（超過5 min），幼胚子葉容易褐化，間接導(dǎo)致材料死亡，從而降低幼胚的萌發(fā)率。綜合考慮，升汞消毒時(shí)間在3～5 min為最佳。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

從表3可以看出，兩種基本培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)桂花幼胚萌發(fā)，當(dāng)6-BA為1.5 mg/L、無GA添加時(shí)，在B5培養(yǎng)基上幼胚的萌發(fā)率可高達(dá)80%，35天時(shí)平均能長出6對(duì)真葉，而在MS培養(yǎng)基中，其萌發(fā)率僅為55.6%，且誘導(dǎo)苗生長緩慢。綜合考慮萌發(fā)率及幼苗的生長勢，誘導(dǎo)桂花幼胚萌發(fā)較好的基本培養(yǎng)基為B5。表3還表明，單獨(dú)使用6-BA或者GA，均能誘導(dǎo)幼胚萌發(fā)，但幼胚培養(yǎng)的萌發(fā)率均未超過80%，且幼苗生長較緩慢，真葉較少，長勢不夠好。

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不同品種桂花幼胚萌發(fā)的影響

正交試驗(yàn)結(jié)果（圖1、圖2）表明，多種培養(yǎng)基配方均可誘導(dǎo)桂花幼胚萌發(fā)，但萌發(fā)率與生長勢存在較大差異。在添加2 mg/L GA的培養(yǎng)基上，籽銀桂的萌發(fā)率可達(dá)到100%，大花金桂和籽丹桂的萌發(fā)頻率較低，均未超過80%（圖1）。綜合萌發(fā)率、真葉數(shù)量、長勢、株高（圖2）等情況，適合不同品種幼胚萌發(fā)的培養(yǎng)基為大花金桂：B5+6-BA（1 mg/L）+GA（3 mg/L）；籽銀桂：B5+6-BA（2 mg/L）+GA（2 mg/L）；籽丹桂：B5+6-BA（1.5 mg/L）+GA（1 mg/L）。

2.4 不同生根培養(yǎng)基組合對(duì)桂花幼胚萌發(fā)苗生根的影響

當(dāng)無菌苗長出2～3對(duì)真葉、株高3 cm時(shí)進(jìn)行生根誘導(dǎo)。對(duì)幼苗進(jìn)行3種處理：保留完整胚根、于根頸處切除胚根、于根頸以下3～4 mm處截?cái)嗯吒?，轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。結(jié)果（表4）顯示，從胚根根頸處切除的材料發(fā)根能力遠(yuǎn)弱于具備完整胚根或具備部分胚根的材料。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有完整胚根的桂花材料，其主根產(chǎn)生一定量的愈傷組織然后再萌發(fā)側(cè)根（圖3～6），完全去除胚根的材料其下部會(huì)產(chǎn)生大量的愈傷組織，降低生根率（圖3～4）。帶有部分胚根的材料，NAA 濃度為2 mg/L時(shí)，生根率最高可達(dá)100%，且單株生根數(shù)也最多，根較粗壯（圖3～5）。當(dāng)NAA濃度高于3 mg/L時(shí)，根部愈傷化嚴(yán)重，且時(shí)間長容易褐化，發(fā)根能力下降。低于2 mg/L時(shí)發(fā)根率下降且根生長非常緩慢。因此，1/2MS +NAA （2 mg/L）適合桂花的生根培養(yǎng)。

生根的胚苗在三角瓶中進(jìn)行煉苗處理，5天后移入腐殖土中，加強(qiáng)管理，成活率可高達(dá)70%。

3 討論

3.1 基本培養(yǎng)基

MS與B5基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最常用的基本培養(yǎng)基類型。MS培養(yǎng)基含有較高的鉀鹽和硝酸鹽，B5培養(yǎng)基鉀鹽含量較高，但硝酸鹽含量較低。梁茂廠等（2007）[9]認(rèn)為MS培養(yǎng)基（MS+l～1.5 mg/L 6-BA）有利于桂花幼胚的萌發(fā)。近幾年來在一些樹種成功的離體培養(yǎng)中，多數(shù)選用MS培養(yǎng)基。袁王俊等[6]以籽銀桂為材料，設(shè)置不同基本培養(yǎng)基進(jìn)行幼胚萌發(fā)試驗(yàn)，認(rèn)為B5培養(yǎng)基適合桂花幼胚萌發(fā)。本試驗(yàn)綜合考慮幼胚的萌發(fā)率和長勢，認(rèn)為較好的基本培養(yǎng)基為B5，這個(gè)結(jié)果與袁王俊的試驗(yàn)一致?？赡茉谟着呙劝l(fā)中對(duì)鉀鹽的需求量較大，在幼苗的生長過程中，過高的鉀鹽可能有抑制作用。

3.2 不同品種桂花幼胚萌發(fā)率及長勢存在差異

圖1、圖2顯示，3個(gè)桂花品種間的幼胚萌發(fā)率及長勢整體平均差異較大，籽銀桂的萌發(fā)率相對(duì)較高，大花金桂及籽丹桂的萌發(fā)率相對(duì)較低。袁王俊等[6]取不同發(fā)育時(shí)期的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)成功率差異很大：球形期胚及魚雷期的胚基本不能萌發(fā)，胚乳硬化后的萌發(fā)率達(dá)到最高點(diǎn)，認(rèn)為桂花胚的離體培養(yǎng)應(yīng)該在胚乳硬化到種子完全

1：2天幼胚； 2：10天變綠的幼胚； 3：30天萌發(fā)的幼苗；4～6：生根誘導(dǎo)

成熟前進(jìn)行。在本試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)雖然在同一時(shí)間內(nèi)取材，但不同品種桂花幼胚的發(fā)育時(shí)期有著差異，籽丹桂中，幼胚胚乳多處于未硬化階段，其萌發(fā)力很弱，容易褐化，幼胚的剝離也比較困難。3個(gè)品種的桂花在基因組水平上也可能存在一定的差異，引起幼胚萌發(fā)及幼苗長勢的差異。

3.3 6-BA及GA對(duì)幼胚萌發(fā)的作用

研究表明，一定濃度的GA，能打破種子的休眠，促進(jìn)種子的萌發(fā)，細(xì)胞分裂素能促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和分化，試驗(yàn)中顯示在基本培養(yǎng)基中添加6-BA和GA均可促使桂花幼胚提前萌發(fā)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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