“泰山紅”石榴高頻再生體系構(gòu)建

摘 要：以“泰山紅”石榴帶芽莖段為外植體，進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，并建立了高頻再生體系，為今后的遺傳轉(zhuǎn)化和育種研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，最佳初代培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L BA+0.3 mg/L IBA+2 g/L PVP，成芽率達(dá)85.7%，成芽個(gè)數(shù)為4.3。最佳增殖培養(yǎng)基為B5+0.6 mg/L BA+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L AgNO3+0.2 mg/L GA3+100 ml/L 椰汁+2 g/L PVP，增殖系數(shù)達(dá)5.8。最佳生根培養(yǎng)基為B5+1.0 mg/L IBA+100 ml/L 椰汁，生根率達(dá)94.0%，移栽成活率達(dá)89.0%。

關(guān)鍵詞：石榴；莖段；組織培養(yǎng)；再生體系

中圖分類號：S686.04+3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0011-06

石榴（Punica granatum L.）為石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）多年生落葉樹種，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會效益和觀賞價(jià)值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹[1，2]。石榴作為果樹和觀賞植物在我國已有2 000 多年的栽培歷史，種質(zhì)資源極為豐富[3，4]，目前中國石榴栽培面積位居世界第一[5]。 “泰山紅”石榴是山東省果樹研究所1996年選育的優(yōu)良品種[6]，該品種果型大，汁液多，味極甜，耐貯運(yùn)，適應(yīng)性強(qiáng)，商品價(jià)值極高[7，8]，不僅是山東的主栽品種之一[9]，也在江蘇、河南、安徽等省大面積栽植。

近年來，石榴的組織培養(yǎng)工作取得了很大進(jìn)展，涉及的外植體材料包括莖尖[10]、莖段[11，12]、葉片[13]、花藥[14]和胚[15～17]等，初步建立了石榴不同外植體材料的再生體系，并且已經(jīng)得到了人工種子[18]。與一般園藝植物相比，石榴組織培養(yǎng)中存在著難分化、易褐化[19]、易玻璃化、易落葉[20，21]、增殖系數(shù)不高[22]等問題。在前人基礎(chǔ)上，本研究旨在系統(tǒng)解決石榴組培中的上述難題，以“泰山紅”石榴為材料，探索通過莖尖和莖段培養(yǎng)建立完整高頻再生體系的關(guān)鍵技術(shù)。另外，組織培養(yǎng)技術(shù)已不僅是單純滿足工廠化生產(chǎn)的需求，還可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善[23]，更是作為重要基礎(chǔ)和手段向著遺傳轉(zhuǎn)化[24]、生物技術(shù)育種[25]和轉(zhuǎn)基因工程等方向發(fā)展[26～28]。因此，本研究的結(jié)果還為“泰山紅”石榴以后的遺傳轉(zhuǎn)化、多倍體育種和轉(zhuǎn)基因育種等工作奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以山東省果樹研究所苗圃基地的“泰山紅”石榴為材料，于2011年12月采集成年植株一年生休眠枝條，插入清水中置于室溫和自然光下培養(yǎng)，待芽萌發(fā)抽枝長至2～5個(gè)節(jié)時(shí)，取其帶芽莖段作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與初代培養(yǎng) 取新萌發(fā)的幼嫩枝條，去掉2/3葉片，剪成1.5 cm左右的帶芽莖段，用洗潔精稀溶液浸泡振蕩洗滌10 min，自來水沖洗干凈后，置于超凈工作臺上滅菌。75%的酒精表面殺菌30 s，無菌水沖洗2遍；5%的NaClO溶液浸泡振蕩8 min，無菌水沖洗5遍；取出莖段剪去兩端變色部分2 mm左右，置于4‰的PVP溶液中浸泡10 min，取出用無菌濾紙吸干并接種于加有不同濃度BA、NAA和IBA的MS初代培養(yǎng)基上（圖版A）。16℃弱光培養(yǎng)10 d后進(jìn)行正常培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度（24±1）℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間14 h/d，下同。每個(gè)處理20瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)成芽率和成芽數(shù)。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 當(dāng)誘導(dǎo)出的腋芽長至2～3 cm 時(shí)，從基部切下后轉(zhuǎn)入MS和B5兩種增殖培養(yǎng)基中，添加BA和IBA并設(shè)不同濃度。加入2 g/L PVP防褐變，加入AgNO3促進(jìn)不定芽的再生，加入GA3防止玻璃化，加入椰汁防莖尖壞死和葉片變黃脫落。做不同封口材料塑料蓋和透氣性膜的比較處理。30 d后觀察記錄增殖系數(shù)和長勢。

本研究中，石榴的增殖芽有兩種類型，一種為叢生芽，增殖系數(shù)以分出的單株芽計(jì)算；另一種為單株芽，其節(jié)位上有腋芽萌發(fā)，增殖系數(shù)以腋芽（大于2 mm）萌發(fā)的節(jié)位個(gè)數(shù)計(jì)。各處理組合如表1所示。

1.2.3 生根培養(yǎng)和移栽 當(dāng)增殖芽長到3～5 cm時(shí)，從基部切下轉(zhuǎn)入B5或1/2B5培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。加入不同濃度的IBA，采用一步和兩步生根法，并比較處理效果。一步生根法，即首先在加有100 ml/L椰汁和不同濃度IBA的B5或1/2B5培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入常規(guī)光照培養(yǎng)。二步生根法，即首先接種到附加不同濃度IBA的B5培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入加有100 ml/L椰汁且不加任何激素的1/2B5培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)光照培養(yǎng)。