參附注射液對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

仲智勇,時(shí)保軍,周輝,王文博

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050017)

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參附注射液對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

仲智勇,時(shí)保軍,周輝,王文博

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050017)

目的觀察參附注射液對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞，分為低、中、高濃度組及對(duì)照組。低、中、高濃度組分別加入0.4、0.8、1.2 mg/mL參附注射液2 mL,對(duì)照組加入等量無菌DMSO培養(yǎng)液。干預(yù)24 h時(shí)采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，采用流式細(xì)胞儀測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞p53、B細(xì)胞淋巴瘤因子l-2(bcl-2)蛋白。結(jié)果干預(yù)24 h時(shí)低濃度組、中濃度組、高濃度組、對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率分別為22.83%±5.18%、35.76%±6.01%、54.51%±9.07%、6.39%±2.81%，組間比較，P均<0.05。干預(yù)24 h時(shí)低濃度組、終濃度組、高濃度組、對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為14.59%±1.24%、18.27%±1.73%、21.85%±1.62%、3.92%±1.36%，組間比較，P均<0.05。各組細(xì)胞p53的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對(duì)照組，P均<0.05；bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對(duì)照組，P均<0.05。結(jié)論參附注射液可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與降低p53表達(dá)、升高bcl-2表達(dá)有關(guān)。

參附注射液；腎母細(xì)胞瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；p53；B細(xì)胞淋巴瘤因子-2

腎母細(xì)胞瘤是小兒常見的腎臟惡性腫瘤，占兒童腎臟腫瘤的95%[1]。目前，臨床常用的治療方式有手術(shù)、放化療等，但并發(fā)癥較多。尋找敏感且不良反應(yīng)較少的抗腎母細(xì)胞瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)。參附注射液源自古文“參附湯”，由紅參、黑附片兩味藥經(jīng)現(xiàn)代提取工藝提取制成，主要含人參皂苷、人參三醇和烏頭堿等生物活性成分，具有回陽救逆、益氣固脫作用，可增強(qiáng)心肌收縮力、清除氧自由基，另具有調(diào)節(jié)機(jī)體及抗腫瘤等作用[2,3]，已廣泛應(yīng)用于心血管、呼吸系統(tǒng)疾病的治療。p53和B細(xì)胞淋巴瘤因子-2(bcl-2)是臨床常用的細(xì)胞凋亡指標(biāo)。近年研究顯示，參附注射液對(duì)肺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤均有一定的臨床效果[4]，但對(duì)于腎母細(xì)胞瘤的相關(guān)報(bào)道較少。2014年3～12月，我們觀察了參附注射液對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞度提供；參附注射液購自雅安三九藥業(yè)有限公司；bcl-2羊抗人多克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體勻購自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組化ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自廣州華美生物工程公司;熒光標(biāo)記兔抗羊IgG購自上海微蒙生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自Sigma公司,基因組DNA抽提試劑盒購自艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC流式試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購自上海通善生物科技有限公司，核酸電泳儀、轉(zhuǎn)膜電泳儀購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞分組及干預(yù)取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于96孔板，1.0×104/孔。將細(xì)胞分為低、中、高濃度組及對(duì)照組4組，每組6個(gè)復(fù)孔，低、中、高濃度組分別加入0.4、0.8、1.2 mg/mL參附注射液2 mL,對(duì)照組加入等量無菌DMSO培養(yǎng)液，置于37 ℃、5 %CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)采用MTT法。取干預(yù)24 h各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 1.0×104/孔接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h時(shí)加入5 mg/mLMTT 20 μL， 4 h后棄上清液，加入200 mL DMSO振蕩。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=1-(觀察組OD值/ 空白組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡率測(cè)算采用流式細(xì)胞儀。收集干預(yù)24 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于6孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min，加入結(jié)合緩沖液 200 mL 、Annexin V-FITC 10 μL，室溫下避光放置15 min，加入結(jié)合緩沖液300 mL、PI 5 μL，混勻后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞p53、bcl-2 蛋白檢測(cè)采用Western blot法。取干預(yù)24 h時(shí)各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 1.0×105/孔接種于6孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔。PBS沖洗3遍，裂解、13 000 r/min、4 ℃離心5 min，精密移取上清液。用瓊脂糖凝膠電泳，取下凝膠，PVDF膜300 mA 轉(zhuǎn)膜110 min，加入適量的封閉液封閉60 min，再分別用封閉液稀釋抗p53、bcl-2多克隆抗體濃度至0.1 μg/mL，加到PVDF膜的正面，4 ℃冷藏過夜，PBS沖洗5 min，連續(xù)沖洗5次。將兔抗羊IgG用5%脫脂奶粉封閉液稀釋2 000倍，置于PVDF膜中,25 ℃下放置60 min， PBS沖洗5 min，連續(xù)沖洗5次。以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠圖像分析儀分析各組p53、bcl-2 蛋白表達(dá)條帶的光密度，以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較干預(yù)24 h時(shí)低濃度組、中濃度組、高濃度組、對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率分別為22.83%±5.18%、35.76%±6.01%、54.51%±9.07%、6.39%±2.81%，組間比較，P均<0.05。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較干預(yù)24 h時(shí)低濃度組、終濃度組、高濃度組、對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為14.59%±1.24%、18.27%±1.73%、21.85%±1.62%、3.92%±1.36%，組間比較，P均<0.05。

2.3各組細(xì)胞p53、bcl-2 蛋白表達(dá)量比較各組細(xì)胞p53的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對(duì)照組，P均<0.05；bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對(duì)照組，P均<0.05。見表1。

表1　干預(yù)24 h各組細(xì)胞p53、bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05；與低濃度組比較，#P<0.05；與中濃度組比較，ΔP<0.05。

3　討論

腎母細(xì)胞瘤的發(fā)病因素涉及多個(gè)基因[5]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系。p53基因是腫瘤領(lǐng)域眾多相關(guān)的抑制基因中研究得最為廣泛、最為系統(tǒng)的抑癌基因。p53基因是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因之一，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，避免細(xì)胞癌變發(fā)生。在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。由p53編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。p53基因突變是腫瘤中最常見的分子遺傳學(xué)改變[6～8]。輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可通過ATM激活p53，阻斷細(xì)胞周期，并提高Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53基因不僅可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還與細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有關(guān)[9]。p53基因是重要的腎母細(xì)胞瘤抑癌基因，研究顯示對(duì)化療藥物敏感的腫瘤細(xì)胞含有野生型p53基因，而含有突變型p53型基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物具有一定的抵抗性。這時(shí)，只有加大化療藥物的用量才可激活p53依賴的凋亡作用[10，11]。bcl-2是一種原癌基因,是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12，13]。細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后，促凋亡因子Bax發(fā)生寡聚化，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，并與膜上的電壓依賴陰離子通道相互作用，使通道開放到足以使線粒體內(nèi)的凋亡因子如細(xì)胞色素C等釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引起細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。bcl-2的過量表達(dá)常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥而阻止細(xì)胞凋亡，影響治療效果。bcl-2基因直接或間接使細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，增加遺傳物質(zhì)突變率及細(xì)胞數(shù)增多，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2在多種腫瘤中均有表達(dá)，如腎癌、胰腺癌、食管癌、淋巴造血組織、胃癌等[15～17]。

參附注射液可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與其阻斷多能干細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)I-κB免疫抑制因子的表達(dá)，抑制TNF-α的表達(dá)有關(guān)。藥理研究顯示，參附注射液可抑制大鼠缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡，可能是與參附注射液上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)及下調(diào)p53蛋白表達(dá)有關(guān)[18]。臨床研究顯示，參附注射液在一定程度上對(duì)惡病質(zhì)細(xì)胞因子具有下調(diào)作用，而且可改善患者的厭食等癥狀[19]。參附注射液的主要生物活性成分為人參皂苷、人參三醇和烏頭堿，均可降低Caspase3、7酶活性，顯著下調(diào)羥化酶CYP4A1基因表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)bcl-2基因表達(dá)，最終下調(diào)Bax基因表達(dá)[20]。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)24 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率均為對(duì)照組<低濃度組<中濃度組<高濃度組，p53的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對(duì)照組，bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對(duì)照組。因此，參附注射液可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其具體作用機(jī)制可能與其抑制p53表達(dá)、促進(jìn)bcl-2表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Shenfu injection on proliferation and apoptosis of Wilm's tumor cells

ZHONGZhiyong,SHIBaojun,ZHOUHui,WANGWenbo

(TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo investigate the effects and related mechanism of Shenfu injection on the proliferation and apoptosis of Wilm's tumor cells in vitro. MethodsWilm's tumor cells were divided into the control group, low-dose, medium-dose and high-dose groups. The low-dose, medium-dose and high-dose groups were treated with 2 mL of 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL and 1.2 mg/mL Shenfu injection, and the control group was added with DMSO. After 24-hour intervention, the proliferation inhibition rate was detected by MTT, the rate of apoptosis and the expression of p53 and Bcl-2 protein was detected by flow cytometry and Western blotting, respectively.ResultsAfter 24-hour intervention, the proliferation inhibition rates of the low-dose group, medium-dose group, high-dose group and the control group were respectively 22.83%±5.18%, 35.76%±6.01%, 54.51%±9.07% and 6.39%±2.81%, allP<0.05. After 24-hour intervention, the apoptosis rates of the low-dose group, medium-dose group, high-dose group and the control group were 14.59%±1.24%, 18.27%±1.73%, 21.85%±1.62% and 3.92%±1.36%, respectively, allP<0.05. The relative expression of p53 was high-dose groupmedium-dose group>low-dose group>control group, allP<0.05. Conclusion Shenfu injection can inhibit the proliferation of Wilm's tumor cells and induce its apoptosis, and the mechanism may be related with the down-regulated expression of p53 and up-regulated expression of Bcl-2.

Shenfu injection; Wilm's tumor; cell proliferation; apoptosis; p53; B lymphocyte-2

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃項(xiàng)目(20130151)。

仲智勇(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樾耗[瘤。E-mail： zhongzy2005@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.006

R737.1

A

1002-266X(2016)18-0018-03

2016-01-16)