159株志賀菌耐藥及非典型1類整合子基因盒攜帶情況分析

劉奉云，王俊，董麗娟，吳曉妹，祁偉

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,天津300211)

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159株志賀菌耐藥及非典型1類整合子基因盒攜帶情況分析

劉奉云，王俊，董麗娟，吳曉妹，祁偉

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,天津300211)

目的觀察志賀菌臨床耐藥情況及非典型1類整合子基因盒的攜帶情況。方法采用K-B紙片法對天津地區(qū)3所三級甲等醫(yī)院分離的159株志賀菌進行藥敏試驗，分析其耐藥情況。采用RT-PCR法檢測志賀菌1類整合子基因盒攜帶情況，并進行基因測序分析其耐藥基因盒類型。結(jié)果159株志賀菌中，對3種及3種以上抗菌藥耐藥148株(93.1%)，抗生素耐藥情況分別為四環(huán)素85.5%、復(fù)方新諾明82.4%、氨芐西林82.4%；攜帶1類整合子基因盒134株，其中非典型1類整合子106株(66.7%);非典型1類整合子可變區(qū)攜帶的耐藥基因盒 blaox a-30-aadA1(6.6%)、aadA5R(4.7%)、dfrA12R(57.5%)。 結(jié)論志賀菌多藥耐藥現(xiàn)象較明顯，菌株攜帶非典型1類整合子比例較高，其主要可變區(qū)耐藥基因盒種類為dfrA12R。

非典型1類整合子；志賀菌；多重耐藥；基因盒；耐藥性

引起細菌性痢疾的志賀菌屬是發(fā)展中國家感染性腹瀉主要致病菌之一[1]，近年廣譜抗生素的濫用導(dǎo)致志賀菌耐藥情況逐年增多，甚至出現(xiàn)多重耐藥性，造成治療效果不佳。非典型1類整合子耐藥基因盒可能與細菌耐藥性有關(guān)。2014年8月～2015年4月，我們觀察了天津地區(qū)臨床分離的159株志賀菌中非典型1類整合子基因盒攜帶情況，并分析志賀菌的多重耐藥情況，分析其在臨床分離株中的分布及與多重耐藥的關(guān)系，旨在為臨床用藥提供參考依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料臨床分離的志賀菌159株為本研究所保存，來自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市兒童醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院3所三級甲等醫(yī)院腸道門診非重復(fù)腹瀉患者糞便。患者中男75例、女84例，年齡17～38歲；均經(jīng)常規(guī)生化以及血清凝集試驗鑒定分型證實，其中福氏志賀菌(B群)63株(39.6%)、粗糙型宋內(nèi)志賀菌(R群)96株(60.3%)。

1.2志賀菌臨床株耐藥情況觀察參照美國2013年臨床實驗室標準化研究所(CISI)的規(guī)定,采用改良K-B紙片擴散法進行藥敏試驗。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。抗生素藥敏紙片包括：氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、頭孢哌酮、氯霉素共計14種，購自北京天壇生物制品研究所。觀察149株志賀菌臨床株的耐藥情況，計算耐藥率。耐藥率=耐藥菌株/總菌株×100%。所有操作嚴格按照使用說明書進行。

1.3志賀菌非典型1類整合子基因盒攜帶情況觀察采用煮沸法提取志賀菌總DNA[2]，RT-PCR法檢測志賀菌1類整合子基因盒攜帶情況。引物設(shè)計及反應(yīng)所需體系條件參照文獻[3]進行，引物合成以及PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，電壓220 V、功率2 W條件下進行30 min的脈沖場凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，采用BLAST程序(美國BIO-RAD 公司)和GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析非典型1類整合子基因盒攜帶情況[4,5]。

2　結(jié)果

2.1志賀菌耐藥情況159株志賀菌耐藥情況見表1。耐藥情況依次為四環(huán)素 85.5%、復(fù)方新諾明 82.4%、氨芐西林82.4%，未見亞胺培南耐藥。 159株志賀菌中多重耐藥菌148株，占全部菌株的93.1%。

2.2志賀菌非典型1類整合子基因盒攜帶情況159株志賀菌中典型1類整合子陽性志賀菌24株，其中福氏志賀菌20株，宋內(nèi)志賀菌4株；非典型1類整合子志賀菌106株，其中福氏志賀菌20株，宋內(nèi)志賀菌86株。攜帶非典型1類整合子的106株志賀菌中，可變區(qū)耐藥基因陽性志賀菌70株。其中3株可變區(qū)可同時檢測到耐藥基因dfrA12R與 aadA5R。106株非典型1類整合子基因盒攜帶情況為：blaoxa-30-aadA1 7株(6.6%)、aadA5R0 5株(4.7%)、dfrA12R 61株(57.5%)。

表1　159株志賀菌藥敏結(jié)果

3　討論

志賀菌是細菌性痢疾的主要致病菌，本研究所收集天津地區(qū)3家大型綜合醫(yī)院臨床非重復(fù)分離的159株志賀菌中，宋內(nèi)志賀菌株比例(60.3%)高于福氏志賀菌株(39.6%)，與本所上世紀90年代及新世紀的研究結(jié)果[6]不一致，說明天津地區(qū)導(dǎo)致細菌性痢疾的志賀菌血清型發(fā)生變化。

目前研究表明，橫向獲得外源性耐藥基因是大多數(shù)細菌產(chǎn)生耐藥性特別是多重耐藥的主要原因之一。而整合子是天然的克隆和表達的工具，可攜帶開放閱讀框(ORF) 并將其轉(zhuǎn)化為功能性基因，主要包括3部分：5′保守末端、可變區(qū)和3′保守末端。根據(jù)5′保守末端所含整合酶種類分為10種類型，常見為1類、2類、3類整合子，而非典型1類整合子是指應(yīng)用常規(guī)PCR擴增，1類整酶呈陽性，而3′保守末端由于插入或者刪除某片段呈陰性的整合子。非典型1 類整合子位于細菌染色體的Tn21轉(zhuǎn)座子上[7]。本研究中，106株志賀菌攜帶非典型1類整合子，其中福氏志賀菌20株、宋內(nèi)志賀菌86株。耐藥基因盒dfrA12R編碼葉酸二氫還原酶,導(dǎo)致對甲氧芐啶的耐藥。本研究中，非典型1類整合子blaoxa-30-aadA1基因盒的陽性率(6.6%)相比較菌株對氨芐西林和鏈霉素耐藥率較低，同樣，dfrA12R耐藥基因盒的陽性率與復(fù)方磺胺甲惡唑耐藥率亦不相符，即實驗菌株對相關(guān)抗菌藥的耐藥率高，而耐藥基因盒的檢出率低，可能是耐藥基因位于整合子可變區(qū)之外的原因。國內(nèi)也有學(xué)者報道，不同耐藥基因可編碼同一類抗生素耐藥[8]有關(guān)，例如aphA1和aphA15均編碼乙?；D(zhuǎn)移酶，也介導(dǎo)對氨基糖苷類抗生素的耐藥。典型1類整合子基因盒blaoxa-1、blaoxa-10(介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥)，dfrI(介導(dǎo)磺胺類抗菌藥耐藥)亦存在此種現(xiàn)象。而其介導(dǎo)氨基糖苷類抗菌藥耐藥的基因盒aadA1、aadA2、aadA5R 陽性率依次為20.8%、25.0%、12.5%與慶大霉素(54.7%)、鏈霉素(39.6%)、氯霉素(29.6%)的耐藥率基本相符。在Peirano等[9]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，編碼對甲氧芐啶和大觀霉素/鏈霉素耐藥的耐藥基因dfr17和aadA5R主要存在于福氏志賀菌典型1類整合子中；編碼對大觀霉素/鏈霉素的耐藥的耐藥基因aadA1主要存在于宋內(nèi)志賀菌的典型1類整合子可變區(qū)。而本研究中，針對非典型1類整合子可變區(qū)耐藥基因篩查發(fā)現(xiàn)，攜帶基因盒aadA5R志賀菌5株，基因盒dfrA12R志賀菌61株，同時檢測到耐藥基因dfrA12R與 aadA5R的志賀菌3株。推測可能是同種基因盒在不同類型整合子之間傳遞，或由于志賀菌株中典型1類整合子和非典型1類整合子的共存[10]存在一定困難，具體機制尚有待于進一步研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.035

R183.4

B

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2015-08-28)