天門冬組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

摘要：以天門冬（Asparagus cochinchinensis）幼嫩莖段為外植體，考察1 g/L HgCl2滅菌時間對外植體的消毒效果，以及激素濃度組合對外植體愈傷組織、不定芽的誘導(dǎo)和不定芽生根的影響。結(jié)果表明，1 g/L HgCl2處理7 min，外植體褐化率和污染率較低；MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且生長勢最強，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的出芽率最高；1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基中生根率最高，可達76%。

關(guān)鍵詞：天門冬（Asparagus cochinchinensis）；莖段；組織培養(yǎng)

中圖分類號：S567.23+9；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4396—03

天門冬（Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.）為百合科天門冬屬的一種[1]，其藥用塊根性寒，味甘、苦，歸肺、腎、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津等功能，是珍貴的藥用植物。同時，作為一種重要的切葉植物和園林綠化植物，天門冬有廣泛的種植前景。近年來，隨著天門冬藥材的需求量不斷增大，亂挖濫采導(dǎo)致其野生資源日益枯竭，而天門冬的人工栽培雖然取得了一定的成果，但還未廣泛推廣[2，3]。目前，天門冬的栽培繁殖主要依靠分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖增殖系數(shù)較低，成活率受諸多因素影響；種子繁殖發(fā)芽率低，并且發(fā)芽的整齊度不高，出苗所需時間長，種植時難以控制栽植時間，管理費時費工[4]。因此，開展天門冬組織培養(yǎng)技術(shù)研究，可解決種苗缺乏問題，有利于快速繁殖大量優(yōu)質(zhì)的無毒種苗，為天門冬的人工栽培、工廠化和規(guī)?；a(chǎn)等奠定基礎(chǔ)，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集廣西藥用植物園種質(zhì)資源圃中天門冬植株的幼嫩莖段作為天門冬組織培養(yǎng)的外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 HgCl2處理時間對外植體污染率和褐化的影響 取天門冬的幼嫩枝條，用自來水沖洗去掉殘留在枝條上的碎泥等，剪成1.0～2.0 cm長的小莖段，放在加有1%洗潔精的洗滌液中浸泡5～8 min，在自來水下用細流水沖洗20 min。在超凈工作臺上用體積分數(shù)75%的乙醇消毒10～40 s，無菌水沖洗3～5次，1 g/L HgCl2分別處理5、7、10 min，再用無菌水沖洗5次，用棉布吸干部分水分后，切去末端部分組織，供接種用。

將經(jīng)滅菌處理后未變色、無褐化的莖段接入MS+1.5 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基中進行初代培養(yǎng)，接種3周后統(tǒng)計各處理外植體的污染率及褐化情況。

1.2.2 激素組合及濃度對天門冬愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響 當初代培養(yǎng)的不定芽長至0.5～1.0 cm高時，將其轉(zhuǎn)入添加了不同濃度6—BA（0、0.5、1.0 mg/L）、KT（0、0.2、1.0 mg/L）和NAA（0、0.2、1.0 mg/L）的MS培養(yǎng)基中，20 d后統(tǒng)計各處理愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率及生長情況。將獲得的不定芽在MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。

1.2.3 激素濃度對天門冬不定芽生根誘導(dǎo)的效果 以1/2MS為生根培養(yǎng)基，分別附加不同濃度的NAA（0、0.5、1.0 mg/L）和IBA（0、0.5、1.0 mg/L），進行生根培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl2處理時間對外植體污染率和褐化率的影響

天門冬外植體的污染率隨著1 g/L HgCl2處理時間的延長逐漸降低（表1），但褐變率呈上升趨勢。滅菌5 min時，外植體污染率高達87.5%；只有幾個極幼嫩的莖尖未出現(xiàn)污染；滅菌10 min時，滅菌效果最好，污染率大大降低，但同時褐變外植體個數(shù)也增多；滅菌7 min時，雖然污染率仍達17.5%，但誘導(dǎo)效果較好，腋芽萌發(fā)整齊。因此，天門冬外植體的HgCl2滅菌時間宜為7 min。

2.2 激素濃度組合對天門冬莖段愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響

除對照外，添加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)天門冬莖段產(chǎn)生愈傷組織（表2），愈傷組織誘導(dǎo)率為4%～36%，其中MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且生長勢最強。而從不定芽的誘導(dǎo)來看，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的出芽率最高，達到了92%（圖1）。

2.3 激素濃度組合對天門冬不定芽生根的影響

天門冬不定芽在增殖培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT）中培養(yǎng)20 d左右，即可獲得4～5倍的增殖系數(shù)（圖2）。將高約2～3 cm的天門冬不定芽剪下接種到含不同濃度IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，25 d左右后，不定芽基部皮層形成4～6條粗細不一、長1～3 cm的不定根。從表3可以看出，不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)天門冬芽苗生根，單獨添加IBA或NAA時，生根率均較低，為25%～49%。當0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA配合使用時，對生根有明顯的促進作用，生根率達到76%，且生根速度也加快（圖3）。

2.4 煉苗和移栽

煉苗方式、移栽基質(zhì)和光照度對試管苗移栽成活率都有很大的影響。苗高約5 cm時開始煉苗，移栽前先把試管苗移出培養(yǎng)室，閉瓶煉苗6 d，再將培養(yǎng)瓶蓋打開，在全天自然光照、溫度25 ℃的通風(fēng)條件下煉苗3～5 d，移栽時用鑷子或玻璃棒將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水洗干凈根部殘留培養(yǎng)基，移栽入已滅過菌的基質(zhì)中（菜園土與河沙等體積混勻），移栽后7～10 d內(nèi)用塑料薄膜保濕，光照強度以遮光率為60%左右最為適宜，保持空氣濕度在85%以上，每天噴霧1次，14 d左右長出新根，每株平均根數(shù)為2～5條，30 d后試管苗移栽成活率達82%以上。

3 小結(jié)與討論

天門冬作為中成藥、化妝品、飲料及食品等的重要原料被廣泛應(yīng)用[5—7]，采用組培快繁技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量種苗。而在組培快繁過程中，HgCl2處理時間是影響植株莖段初期誘導(dǎo)的最重要因素之一，從理論上來說，HgCl2處理時間越長，滅菌越徹底，滅菌效果越好，但是滅菌時間過長會破壞外植體的組織結(jié)構(gòu)從而引起褐變，降低外植體的成活率。為了盡量減少外植體褐化并獲得較佳滅菌效果，1 g/L HgCl2處理時間宜為7 min。不添加激素的MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)愈傷組織的形成，單獨添加6—BA、KT或NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率及出芽率均較低，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT；最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。天門冬不定芽的生根以IBA和NAA混合使用效果最好，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。

試管苗的移栽成活在組培苗的生產(chǎn)中也非常關(guān)鍵，其在培養(yǎng)室內(nèi)有人工提供的適宜溫度、豐富的養(yǎng)分與充足的水分，因此移栽到自然環(huán)境中前需要進行煉苗，以提高存活率。根長為1 cm左右時移栽最佳，根過長容易折斷，影響成活率。

參考文獻：

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