梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析

摘要：根據(jù)Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從10份梨屬（Pyrus）材料中擴(kuò)增該逆轉(zhuǎn)座子片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆于pMD18—T質(zhì)粒載體，選擇陽(yáng)性克隆，再經(jīng)菌落PCR鑒定、測(cè)序及序列分析，獲得了14條梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列。這些核苷酸序列長(zhǎng)度為250～267 bp，具有較高的異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為缺失突變，通過(guò)核苷酸聚類可將14條序列分為4個(gè)家族。對(duì)這些片段的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有2個(gè)序列發(fā)生了終止密碼子突變。該研究獲得的梨屬植物Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列與已報(bào)道的其他生物的相應(yīng)序列有較高的一致性。

關(guān)鍵詞：Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶；梨（Pyrus）；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號(hào)：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114（2012）19—4388—03

逆轉(zhuǎn)座子（Retrotransposon）是真核生物中種類最多、分布最廣的轉(zhuǎn)座因子，也是高等植物核基因組的重要組成部分[1]。各種生物和非生物因子的脅迫都可能誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，導(dǎo)致基因突變、基因組擴(kuò)增及重排等，造成植物的遺傳變異，從而成為自然選擇的源泉[2—5]，其序列的克隆與分析研究對(duì)于植物基因組組成、進(jìn)化與基因的表達(dá)調(diào)控研究均有重要的意義。迄今已在蘋(píng)果[6，7]、柑橘[8]、柿[9]、葡萄[10]等主要果樹(shù)作物中研究分析了逆轉(zhuǎn)座子的種類和組成。其中Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子在植物界廣泛分布，是研究最多的一類[3—5]。目前關(guān)于梨逆轉(zhuǎn)座子的報(bào)道較少，該研究依據(jù)Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用PCR方法進(jìn)行梨屬植物Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的分離克隆，并通過(guò)序列分析初步研究其變化特點(diǎn)，以期為梨屬植物的逆轉(zhuǎn)座子研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料包括2個(gè)西洋梨（Pyrus communis L.）品種早紅考密斯和康福倫斯，2個(gè)砂梨（P. pyrifolia Nakai.）品種豐水和蒲瓜梨，2個(gè)白梨（P. bretschneideri Rehd）品種雪花梨和鴨梨，2個(gè)秋子梨（P. ussuriensis Maxim）品種安梨和花蓋梨，以及兩個(gè)砧木種杜梨（P. betulaefolia Bge.）和豆梨（P. calleryana Dcne.），共10份材料。

1.2 方法

1.2.1 梨基因組DNA的提取及Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增 取剛展開(kāi)的嫩葉，采用CTAB法[11]提取基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。參照文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的引物，上下游引物序列分別為：5′—ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG—3′，5′—APuCATPuTC

PuTCNACPuTA—3′，其中N=A+T+C+G，Py=A+G，Pu=T+C。PCR反應(yīng)體系為：DNA 20 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.3 μmol/L，2.0 μL 10×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA聚合酶（上海Sunny公司生產(chǎn)），加雙蒸水至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 120 s；94 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)在Bio—Rad S1000型PCR儀上完成。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及轉(zhuǎn)化 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用TaKaRa凝膠回收試劑盒回收早紅考密斯的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物經(jīng)純化后連接于pMD18—T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后PCR鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.3 Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列測(cè)定及序列分析 將鑒定為陽(yáng)性的菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。利用DNAStar和DNAMAN軟件對(duì)獲得的逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1，供試的10份梨屬植物材料均能擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為260 bp的Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶片段，與之前的報(bào)道一致，說(shuō)明Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子在梨屬植物中普遍存在。

2.2 Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列測(cè)定結(jié)果

將以早紅考密斯基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行回收純化、克隆、測(cè)序后，共得到14條序列，全部序列信息已經(jīng)提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為JN639033～ JN639046（表1），這些序列與已知植物的Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列有較高的同源性，說(shuō)明其逆轉(zhuǎn)座子是真實(shí)的。14條序列均富含A、T堿基，其中A、T、C、G堿基的個(gè)數(shù)分別為55～83、70～99、33～68、44～67，AT與GC比例范圍為1.09～1.69。

2.3 Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列和氨基酸序列分析

為了闡明梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶間的相互關(guān)系，利用DNAStar對(duì)分離到的14條逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建梨該類逆轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)Branch的長(zhǎng)度把這14條序列分成4個(gè)家族，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ家族各包括4個(gè)序列，第Ⅲ家族只有2個(gè)序列。14條Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長(zhǎng)度為250～267 bp，短于之前報(bào)道的273 bp[4]，說(shuō)明缺失是造成梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列長(zhǎng)度變化的主要原因。進(jìn)一步分析表明，Pcrt3在第25、27、32和59個(gè)氨基酸處發(fā)生了4個(gè)終止密碼子突變；Pcrt14在第10、55、71和89個(gè)氨基酸處也存在4個(gè)終止密碼子突變（圖3），由此推測(cè)終止密碼子突變可能是逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生突變及不能表達(dá)的主要原因之一。從GenBank中搜索到已登錄的其他生物的Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列，與本研究獲得的14條梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示本試驗(yàn)所克隆到的梨Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列與蘋(píng)果、草莓、柑橘、桃等的有較高的一致性，表明它們可能有共同的起源[13]，也可能是不同物種間逆轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果[14]。

3 討論

本研究首次對(duì)梨屬植物中的Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，從10份材料中均擴(kuò)增出長(zhǎng)度為260 bp左右的目標(biāo)片段，說(shuō)明Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因在梨屬植物中廣泛存在。從西洋梨品種早紅考密斯中獲得了14條Ty1—copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，這些序列表現(xiàn)出較大的變異性，其核苷酸序列為250～267 bp，存在缺失突變；其中2個(gè)序列發(fā)生了4個(gè)終止密碼子突變，由此推斷缺失突變和終止密碼子突變可能是造成逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的重要原因。

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