平臥菊三七中綠原酸提取及純化工藝的優(yōu)化

摘要：采用超聲醇提法從平臥菊三七（Gynura procumbens）中提取綠原酸，設(shè)計正交試驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、pH、超聲功率對綠原酸提取率的影響。通過靜態(tài)吸附—解吸試驗優(yōu)選適合綠原酸純化的大孔樹脂，并運用單因素試驗優(yōu)化動態(tài)吸附—解吸條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超聲功率120 W，此條件下綠原酸得率為3.13%。HPD600型樹脂對綠原酸有較高的吸附率和解吸率，優(yōu)化后的吸附條件為上樣流速2 mL/min、pH 3；適宜的洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)30%和50%的乙醇，純化后綠原酸的純度為77.4%。

關(guān)鍵詞：平臥菊三七（Gynura procumbens）；綠原酸；提??；純化

中圖分類號：R284.2；S567.23+6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4348—04

平臥菊三七（Gynura procumbens （Lour） Merr.）為菊科三七屬多年生草本藥食兩用植物[1]，近代藥理研究表明其具有降壓[2，3]、降糖[4，5]、降脂[5]、抗氧化[6]、消炎[7]、抗癌[8，9]等功效。其主要活性成分有綠原酸、黃酮類、生物堿、萜烯類、香豆素類等[10—13]。綠原酸是植物在有氧呼吸過程中由磷酸戊糖途徑（HMS）的中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)，它包括綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、萊薊素等十多種同分異構(gòu)體，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降糖、清除自由基等作用，是保健品、食品、藥品及化妝品的重要原料。綠原酸在植物界廣泛存在，在忍冬科和菊科植物中含量較高[14—17]。本研究采用超聲波醇提法從平臥菊三七中提取綠原酸，并選用吸附容量大、選擇性好、吸附迅速、解吸容易、再生簡單的大孔樹脂對其進行純化，以期為進一步開發(fā)利用平臥菊三七提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七葉采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園，烘干粉碎后過60目篩，裝袋備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品由湖南瀏陽艾特天然產(chǎn)物研究與開發(fā)有限公司生產(chǎn)；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；大孔樹脂AB—8、S—8、NKA—2、NKA—9、X—5、HPD600、D101、H103均購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

UV—754型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；LXJ—ⅡB低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ3200DB型臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pH計（Thermo電子公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；小型粉碎機（長沙市常宏制藥機械設(shè)備廠）；ZHWY—1102型搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助乙醇浸提法提取綠原酸 ①提取工藝流程。稱取1 g左右平臥菊三七葉樣品粉末→加入適量石油醚揮干備用→超聲波輔助乙醇提取→離心→取上層清液→定容至25 mL→吸取1 mL溶液定容到25 mL容量瓶，得平臥菊三七提取液[18]。②綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[19]。稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的甲醇溶液定容于25 mL的容量瓶，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用移液管分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶液定容，配成濃度分別為8、16、24、32、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見分光光度計在波長328 nm下測定吸光度，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X//μg/mL）與吸光度A328 nm（Y）的回歸方程為Y=0.041 3X—0.015 7，R2=0.999 6（圖1）。③正交試驗優(yōu)化綠原酸提取工藝。設(shè)計正交試驗考察pH、料液比、超聲波超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對平臥菊三七中綠原酸提取率的影響，正交試驗因素與水平見表1。

1.2.2 大孔樹脂純化綠原酸

1）工藝流程。平臥菊三七提取液→依次經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取得水相液作為樣液→上樣于大孔樹脂→不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進行梯度洗脫→接綠原酸含量最高的洗脫液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液除去乙醇→冷凍干燥得綠原酸粗品。

2）樹脂的預(yù)處理[20]。各種樹脂分別用雙蒸水溶脹、浮選后，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4 h，用雙蒸水洗至中性；然后用0.5 mol/L HCl溶液浸泡24 h，不斷攪拌，用雙蒸水洗至中性；再在70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇溶液中浸泡24 h并不斷攪拌，用去離子水洗至無白色渾濁、無乙醇味后用雙蒸水浸泡待用。

3）樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗。①靜態(tài)吸附。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樹脂1 g，裝入150 mL磨口三角瓶中，加入50 mL已測定濃度的樣液，蓋緊瓶塞，在25 ℃恒溫水浴搖床上振搖24 h，充分吸附后過濾，測定吸附液中綠原酸的濃度，按式（1）和式（2）計算吸附量Q和吸附率E。②靜態(tài)解吸。將完成吸附的樹脂過濾后放入150 mL磨口燒瓶中，加入50 mL 70%的乙醇，在25 ℃恒溫水浴搖床上振搖24 h，收集洗脫液，測定吸光度，按式（3）計算解吸率D。

Q=■ （1）

E=■×100% （2）

D=■×100% （3）

式中，Q為吸附量（mg/g）；C0為綠原酸樣品的初始濃度（mg/mL）；Ce為吸附后樣液中綠原酸的濃度（mg/mL）；V為吸附液體積（mL）；W為樹脂質(zhì)量（g）；C2為解吸液的濃度（mg/mL）；V2為解吸液體積（mL）。

4）樹脂的動態(tài)吸附與洗脫試驗。①上樣流速對泄漏率的影響[21]。把處理好的樹脂裝入吸附柱，上樣液流速分別為2、4、6、8、10 mL/min，分別收集不同流速下的流出液，按式（4）計算泄漏率。②上樣液pH對動態(tài)吸附的影響[21]。分別調(diào)節(jié)上柱液的pH為2、3、4、5、6，以一定的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，檢測其中綠原酸的含量，計算其吸附率。③梯度洗脫曲線的繪制。取50 mL的樹脂裝柱，調(diào)節(jié)提取液pH為3，按流速2 mL/min上樣進行吸附。待吸附完全后，依次用去離子水和體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液各5 BV進行洗脫，分別收集每BV洗脫液，測定吸光度，繪制梯度洗脫曲線。

泄漏率=■×100% （4）

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果

平臥菊三七中綠原酸提取工藝的正交試驗結(jié)果見表2，利用DPS軟件進行極差分析、方差分析和Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較，優(yōu)選出超聲波輔助醇提法提取平臥菊三七中綠原酸的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，各因素對綠原酸提取率的影響由大到小依次為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH、超聲功率。其中料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH對綠原酸提取的影響極顯著，超聲功率的影響不顯著。最佳提取工藝為A3B1C2D2，即pH 4、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、超聲功率120 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下進行驗證試驗，得到綠原酸的平均提取率為3.13%，高于正交試驗組合的最高值，說明該結(jié)果是可靠的。

2.2 樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗結(jié)果

表3為8種樹脂對綠原酸的吸附和解吸效果。從表中可以看出，S—8、H103、HPD600的吸附率高于其他5種樹脂，而HPD600的解吸率遠(yuǎn)高于其他類型的樹脂，考慮到綠原酸的極性與大孔樹脂的吸附解吸特性，HPD600樹脂為適合用于綠原酸純化的樹脂。

2.3 HPD600樹脂的動態(tài)吸附與洗脫試驗結(jié)果

2.3.1 上樣流速對泄漏率的影響 上樣流速影響吸附質(zhì)向樹脂表面的擴散，從而決定吸附效果。如果流速太快，吸附質(zhì)分子來不及擴散到樹脂內(nèi)表面就已經(jīng)從柱中流出而泄漏，造成樣品流失，但流速太慢會造成試驗周期過長，增加成本。圖2為不同流速下樣品的泄漏率。從圖中可以看出，綠原酸泄漏率隨上樣流速的加快而升高，上樣流速大于4 mL/min時，綠原酸的泄漏率迅速升高。

2.3.2 上樣液pH對綠原酸吸附率的影響 圖3為上樣液pH對動態(tài)吸附綠原酸吸附率的影響?？梢钥闯?，綠原酸的吸附率隨pH的增大呈先上升后下降的趨勢，pH為3時吸附率最高。這可能是由于綠原酸作為多羥基酚酸在酸性條件下以分子形式存在，疏水性增強，易被樹脂吸附；但在強酸性條件下以內(nèi)酯形式存在的綠原酸易水解。

2.3.3 梯度洗脫曲線的繪制 分別選用體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%、90%的乙醇作為洗脫劑，綠原酸的洗脫效果有較大差異（圖4）。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，洗脫液中綠原酸濃度很低，將此部分洗脫液冷凍干燥，干粉呈淡灰色，在空氣中易吸潮，與蒽酮試劑反應(yīng)呈綠色，與費林試劑反應(yīng)有紅色沉淀產(chǎn)生。這些特點與糖的特性相吻合，因此可以采用10%的乙醇把提取物中糖類化合物分離出來。乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%和50%時均出現(xiàn)了洗脫液濃度峰，這可能是因為紫外分光光度計測得的數(shù)據(jù)為總綠原酸含量，不同濃度洗脫劑的洗脫液中含有不同種類的綠原酸，綠原酸的單體分離工作還有待下一步試驗研究。將此部分洗脫液收集起來，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇再冷凍干燥后得到綠原酸粗品，紫外分光光度法測得綠原酸純度為77.4%。

3 結(jié)論

運用正交試驗得到超聲輔助醇提法從平臥菊三七中提取綠原酸的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超聲功率120 W，綠原酸提取率為3.13%。通過靜態(tài)吸附與解吸試驗得到純化綠原酸的最佳樹脂為HPD600型，通過動態(tài)解吸試驗得到最佳樹脂的吸附—解吸條件為上樣流速2 mL/min、pH 3，分別用5 BV的去離子水和體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇洗脫后依次用5 BV的體積分?jǐn)?shù)30%及50%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去乙醇后冷凍干燥，得到的綠原酸純度為77.4%。

參考文獻：

[1] 陳煥鏞. 海南植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1977.418.

[2] KIM M J， LEE H J， WIRYOWIDAGDO S， et al. Antihypertensive effects of Gynura procumbens extract in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Medicinal Food，2006，9（4）：587—590.

[3] HOE S Z， KAMARUDDIN M Y， LAM S K. Inhibition of angiotensin—converting enzyme activity by a partially purified fraction of Gynura procumbens in spontaneously hypertensive rats[J]. Medical Principles and Practice，2007，16（3）：203—208.

[4] AKOWUAH G A， SADIKUN A， MARIAM A. Flavonoid identification and hypoglycaemic studies of the butanol fraction from Gynura procumbens[J]. Pharmaceutical Biology，2002，40（6）：405—410.

[5] LEE H W， HAKIM P， RABU A. Antidiabetic effect of Gynura procumbens leaves extracts involve modulation of hepatic carbohydrate metabolism in streptozotocin—induced diabetic rats [J]. Journal of Medicinal Plants Research，2012，6（5）：796—812.

[6] YAM M， SADIKUN A， ASMAWI M. Antioxidant potential of Gynura procumbens[J]. Pharmaceutical Biology，2008，46（9）：616—625.

[7] ISKANDER M， SONG Y， COUPAR I， et al. Antiinflammatory screening of the medicinal plant Gynura procumbens[J]. Plant Foods for Human Nutrition（Formerly Qualitas Plantarum）， 2002，57（3）：233—244.

[8] AGUSTINA D， WASITO H S M， SUPATINAH A. Anticarcinogenesis effect of Gynura procumbens（Lour） Merr on tongue carcinogenesis in 4NQO—induced rat[J]. Detal Journal，2006， 39（3）：126—132.

[9] NURULITA N A， MEIYANTO E， MATSUDA E， et al. Gynura procumbens modulates the microtubules integrity and enhances distinct mechanism on doxorubicin and 5—flurouracil—induced breast cancer cell death[J]. Oriental Pharmacy and Experimental Medicine，2012，12（1）：1—14.

[10] 閔伶俐，唐源江.菊三七屬植物研究進展[J].中藥材，2009，32（8）：1322—1325.

[11] HEW C S， GAM L H. The identification of high abundant proteins in the leaves of Gynura procumbens[J].Biotechnology Biotechnological Equipment，2010，24（4）：2132—2136.

[12] 蔣娟娟，徐德然，濮社班，等. 菊三七地下部分的化學(xué)成分[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（3）：178—180.

[13] 國家中醫(yī)藥管理局編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[14] 晏 麗，吳吉林，付 招.紫薇花綠原酸超聲波輔助提取研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：146—147.

[15] 高錦明，張康健. 綠原酸分布、提取與生物活性研究綜述[J].西北林學(xué)院學(xué)報，1999，14（2）：73—82.

[16] 柯銘清.中草藥有效成分理化與藥理特性[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1982.

[17] 劉軍海，裘愛泳.綠原酸及其提取純化和應(yīng)用前景[J].糧食與油脂，2003（9）：44—46.

[18] 王宏軍，吳國娟，李煥榮，等.金銀花中綠原酸提取方法的篩選及其抑菌作用[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2003，18（4）：262—265.

[19] 胡鮮寶，呂加平，劉 鷺，等.葵花粕中綠原酸檢測方法的建立[J].食品工業(yè)科技，2011（2）：341—343.

[20] 熊 偉，胡居吾，李雄輝，等.大孔樹脂分離純化杜仲葉中綠原酸的研究[J].江西科學(xué)，2010，28（2）：178—181.

[21] 劉丹赤.牛蒡葉中綠原酸的提取純化工藝研究[D].濟南：山東師范大學(xué)，2007.