乙烯利對泥鰍5種組織酯酶同工酶表達(dá)的影響

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，在試驗(yàn)水溫23～25 ℃的條件下，研究了乙烯利（ETH）對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）5種組織酯酶（EST）同工酶表達(dá)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度乙烯利處理后，在不同染毒時間下泥鰍5種組織EST同工酶酶譜發(fā)生了不同程度的變化，變化的類型包括：酶帶的缺失、新增及著色的深淺，5種組織EST同工酶的表達(dá)具有明顯的組織差異性，活性由強(qiáng)至弱依次為：脾臟>肝胰臟>鰓>心臟>肌肉；沒有發(fā)現(xiàn)劑量梯度與EST同工酶表達(dá)的正相關(guān)變化，在不同染毒時間下，脾臟、肝胰臟、鰓組織EST同工酶基本上表現(xiàn)為在24 h活性增強(qiáng)，48 h活性達(dá)到最弱，72 h略有增強(qiáng)，96 h又減弱，而心臟和肌肉組織24 h先增強(qiáng)，而后一直減弱的趨勢，表現(xiàn)出明顯的組織差異性和應(yīng)激性。

關(guān)鍵詞：泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；乙烯利；組織；酯酶；同工酶

中圖分類號：X503.225；R155.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4325—05

乙烯與果實(shí)成熟有著密切的關(guān)系，被認(rèn)為是果實(shí)成熟激素。乙烯利（Ethrel，ETH）化學(xué)名稱為2—氯代乙基膦酸，是一種人工合成的乙烯釋放劑，其作為植物生長調(diào)節(jié)劑具有用量小、見效快、殘留少等特點(diǎn)，廣泛用于保護(hù)地反季節(jié)早熟植物栽培[1—3]。近年來，由于存在乙烯利的濫用及隨意提高使用濃度、盲目改變使用時間等現(xiàn)象，乙烯利在果蔬中的殘留已經(jīng)成為影響果蔬食用安全的因素之一[4]。另有研究表明[5]，乙烯利具有一定的神經(jīng)毒性和弱激素樣作用。國外對水果、蔬菜中殘留的乙烯利有嚴(yán)格的限量要求，歐盟最新規(guī)定其最高殘留限量為0.02 mg/kg[6]。于文輝等[4]研究表明，乙烯利對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞具有致突變作用。但關(guān)于乙烯利對魚類組織同工酶表達(dá)的影響目前鮮見報道。

同工酶技術(shù)可指示一些具有特異性的同工酶帶，定性地反映環(huán)境中的污染物。酯酶（EST）同工酶能水解大量非生理存在的酯類化合物，包括某些藥物，具有解毒作用。在環(huán)境毒物存在的情況下，多種動植物EST同工酶的表達(dá)都會有顯著的變化[7]。環(huán)境科學(xué)多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法研究環(huán)境污染物對生物同工酶表達(dá)的影響[8，9]。本研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在水溫23～25 ℃的條件下，研究了乙烯利對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）5種組織EST同工酶表達(dá)的影響，旨在為生活生產(chǎn)中合理使用乙烯利提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用泥鰍購自世紀(jì)華聯(lián)超市，選擇體格健壯、體表無傷、規(guī)格一致的泥鰍，平均體長為（14.56±0.35） cm，平均體重為（27.00±0.26） g。試驗(yàn)前將泥鰍放入曝氣自來水中馴養(yǎng)1周，每天換1次水。乙烯利（分析純）購自上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠。

1.2 方法

1.2.1 染毒試驗(yàn) 根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，以96 h全部存活濃度為最低濃度，全部致死濃度為最高濃度，將試驗(yàn)分為3個試驗(yàn)組和1個空白對照組，每組15尾泥鰍。試驗(yàn)組乙烯利濃度依次為0.06、0.07、0.08 mg/L，空白對照組不添加乙烯利。染毒試驗(yàn)在室內(nèi)容積為10 L的棕色玻璃缸中進(jìn)行，每個玻璃缸加入相應(yīng)處理液4 L，對照組加入曝氣自來水，每24 h換液1次。染毒時間為96 h。試驗(yàn)期間不投餌，僅用簡易增氧機(jī)進(jìn)行增氧，水溫23～25 ℃，pH 7.3，發(fā)現(xiàn)死亡個體及時清除。

1.2.2 采樣 每隔24 h分別從對照組和各試驗(yàn)組隨機(jī)撈取2尾泥鰍，擦干體表水分，將泥鰍置于盛滿冰的解剖盤上解剖，取出心、鰓、脾、肝胰臟、肌肉5種組織，用預(yù)冷的無菌蒸餾水沖洗以除去組織血污，然后用濾紙吸去多余水分。分別取上述5種組織稱重，將組織放入研缽按1∶2的比例（質(zhì)量體積比，g/mL）加入0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，置于冰上研磨成糊狀勻漿。將研磨好的組織倒入離心管中，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液于—20 ℃保存，供同工酶電泳分析用。

1.2.3 電泳 采用周宗漢等[10]的方法制備凝膠，濃縮膠濃度為3.0%，分離膠濃度為7.4%，電極緩沖液為Tris—甘氨酸溶液（pH 8.3）。每孔點(diǎn)樣量為10 μL。電泳時，指示劑（溴酚藍(lán)）在濃縮膠內(nèi)時用70 V電壓，當(dāng)指示劑完全進(jìn)入分離膠后，將電壓升高到150 V，電流控制在15 mA。電泳時間為8 h左右。整個電泳過程于4 ℃進(jìn)行。

1.2.4 染色 染色液配方參照季維智等[11]的方法。電泳結(jié)束后將凝膠取出，用蒸餾水沖洗干凈，放入基質(zhì)染色液中染色，直至清晰條帶出現(xiàn)（約5～10 min）。顯色完成后用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，然后用7%的冰醋酸溶液固定、75%的乙醇脫色，數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.5 同工酶的命名 同工酶酶譜的命名以同工酶縮寫名稱的大寫代表酶蛋白，按從陰極到陽極電泳遷移的方向依次命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利對泥鰍脾臟EST同工酶表達(dá)的影響

由圖1和表1可見，正常情況下泥鰍脾臟EST同工酶共有4條酶帶表達(dá)，分別為Est—4、Est—5、Est—6、Est—7，其中Est—4的活性很強(qiáng)，Est—6和Est—7活性較弱。經(jīng)乙烯利染毒處理后，泥鰍脾臟EST同工酶酶帶遷移率（Rf）分布在0.297～0.803，大多集中在0.406～0.495。在不同染毒時間下，3個試驗(yàn)組有2條共有酶帶，即Est—4和Est—5。低濃度組（A組）在24 h和96 h時分別有Est—7和Est—6出現(xiàn)，且活性均較弱；在96 h時誘導(dǎo)出Est—2，但活性較弱。中濃度組（B組）在整個染毒過程中均有Est—3、Est—4和Est—5表達(dá)，在24 h和48 h時誘導(dǎo)出Est—8。高濃度組（C組）僅在24 h時有Est—6表達(dá)，在72 h時誘導(dǎo)出Est—2，但活性較弱。

2.2 乙烯利對泥鰍肝胰臟EST同工酶表達(dá)的影響

由圖2和表2可見，正常情況下泥鰍肝胰臟EST同工酶有Est—3、Est—4、Est—5共3條酶帶表達(dá)，三者活性較一致。經(jīng)乙烯利染毒處理后，低濃度組（A組）各條帶表達(dá)較好，但是在48 h時條帶明顯減少并且活性減弱，僅有Est—3、Est—5表達(dá)，可能是泥鰍個體差異導(dǎo)致。隨著染毒時間的延長，中濃度組（B組）酶帶數(shù)目趨于增多，并且在96 h時誘導(dǎo)出了惟一的Est—1（Rf =0.382）。高濃度組（C組）EST同工酶活性隨著染毒時間的延長逐漸減弱，但在96 h時活性有所增強(qiáng)，可能是肝胰臟EST對高濃度乙烯利的應(yīng)激作用。總體來說，48 h時3個試驗(yàn)組的酶帶最少，顏色較淺，表明酶活性較弱，96 h時酶帶最多。

2.3 乙烯利對泥鰍鰓EST同工酶表達(dá)的影響

由圖3和表3可見，正常情況下泥鰍鰓EST同工酶有3條酶帶表達(dá)，分別為Est—2、Est—3、Est—4。經(jīng)乙烯利染毒處理后，隨著乙烯利濃度的升高及染毒時間的延長，同工酶條帶數(shù)和活性發(fā)生了一些變化，但條帶總體上分布比較集中，Rf在0.410～0.495，部分低濃度組（A3和A4）及全部中濃度組（B組）都誘導(dǎo)出Est—1，其活性被激發(fā)，Est—4只在對照組及B3、C3組有表達(dá)。泥鰍鰓EST同工酶在24 h時活性逐漸增強(qiáng)，48 h時稍有減弱，到72 h時酶帶顏色較深、寬度較寬，酶活性較強(qiáng)，96 h時酶活性又有所減弱。乙烯利對鰓EST同工酶表達(dá)的影響主要表現(xiàn)為：在一定濃度下對部分酶帶的抑制（Est—4）或誘導(dǎo)（Est—1），其活性變化不大。

2.4 乙烯利對泥鰍心臟EST同工酶表達(dá)的影響

由圖4和表4可見，正常情況下泥鰍心臟EST同工酶共有3條酶帶表達(dá)，分別為Est—2、Est—3、Est—4，其中Est—2活性較強(qiáng)。與鰓組織相似，心臟EST同工酶酶帶分布也比較集中，Rf在0.363～0.437。低濃度組（A組）在24 h與48 h下表達(dá)Est—2、 Est—3兩條酶帶，在72 h和96 h時誘導(dǎo)出Est—1，但活性較弱。中濃度組（B組）在24 h時誘導(dǎo)出Est—1，且活性較強(qiáng)，在48 h和96 h時均僅有Est—1表達(dá)，其他3條酶帶缺失。而高濃度（C組）在96 h時誘導(dǎo)出Est—1，且活性很強(qiáng)。從24 h至72 h，心臟EST同工酶活性呈逐漸減弱的趨勢，至96 h時活性又有所增強(qiáng)。

2.5 乙烯利對泥鰍肌肉EST同工酶表達(dá)的影響

由圖5和表5可見，正常情況下泥鰍肌肉EST同工酶共有3條酶帶表達(dá)，其中Est—2活性很強(qiáng)，推測與心臟一樣，肌肉EST的含量也較少。肌肉EST同工酶Rf在0.394～0.500，條帶分布較集中。低濃度組（A組）在24、48及96 h時均表達(dá)Est—2和 Est—3兩條酶帶，但在72 h時僅表達(dá)Est—4，且活性較弱。中濃度組（B組）在整個染毒過程中均有Est—1和 Est—3表達(dá)，且活性較弱；在24 h和96 h時Est—2表達(dá)強(qiáng)烈，其活性與對照組相當(dāng)。高濃度組（C組）僅在24 h時Est—2的活性很強(qiáng)；在72 h時誘導(dǎo)出Est—1，但活性較弱。

3 討論

EST是生物體內(nèi)催化羧酸酯類化合物水解和合成的一類酶，具有明顯的多態(tài)性、高度的組織特異性和種族特異性[7]。EST同工酶是生物體內(nèi)的天然標(biāo)記之一。靳曉敏等[12]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板不連續(xù)電泳法分析了高效反式氯氰菊酯和功夫菊酯在不同注射劑量、不同攻毒時間條件下對鯉肝胰臟EST同工酶的影響，結(jié)果表明注射不同劑量農(nóng)藥攻毒后，在不同攻毒時間下EST同工酶酶譜發(fā)生了不同程度的變化，變化的類型包括：酶帶的缺失、新增及著色的深淺，這與本研究的結(jié)果一致。本研究表明，對照組除脾臟EST同工酶表達(dá)4條酶帶外，其余4種組織均為3條，而經(jīng)乙烯利染毒處理后，各組織EST同工酶表現(xiàn)出明顯的組織特異性，根據(jù)酶帶數(shù)目和染色的深淺，各組織EST同工酶活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋浩⑴K>肝胰臟>鰓>心臟>肌肉。據(jù)此推測，乙烯利對泥鰍脾臟的損害作用最強(qiáng)，對肌肉損害最弱。其中，脾臟與其他組織相比，酶帶遷移率極差最大、酶帶數(shù)目最多、染色最深，表明其活性也最強(qiáng)。尹紹武等[13]對褐點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）不同組織4種同工酶研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的EST同工酶酶帶最多、活性最強(qiáng)。賈秀英等[14]研究了不同濃度的鉛對蟾蜍（Bufobufo gargarizans）肝臟、腎臟過氧化物酶和EST同工酶的影響，結(jié)果表明不同濃度的鉛均可使肝、腎組織過氧化物酶同工酶活性發(fā)生明顯變化；對肝、腎EST同工酶的影響表現(xiàn)出一定的組織差異性，且在一定范圍內(nèi)主要表現(xiàn)為應(yīng)激性，即低劑量的鉛可誘導(dǎo)酶活性的升高。而本研究發(fā)現(xiàn)，脾臟EST同工酶活性在5種組織中最強(qiáng)，其原因可能是由于脾臟參與體液免疫和炎癥反應(yīng)，對內(nèi)源性或外源性異物進(jìn)行貯存、破壞或脫毒有關(guān)[15]。肝胰臟EST同工酶的酶帶集中、染色較深，但酶帶數(shù)目沒有脾臟多，可能是因?yàn)楦我扰K是解毒器官，與其解毒功能有關(guān)。鰓EST同工酶的表達(dá)與肝胰臟相比較弱，但其酶帶染色較深、分布較集中。正常情況下，心臟與肌肉都只有3條酶帶，且活性較弱。牛紅星等[16]研究了毛腿鼠耳蝠（Myotis fimbriatus）不同組織EST同工酶的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟和胸肌僅表達(dá)3條相同的酶帶，且酶活性相近，推測可能與心臟和肌肉中EST含量較少有關(guān)。

王蘭等[15]研究了鎘對中華絨螯蟹（Sinopotamon yangtsekiense）組織器官EST同工酶的影響，認(rèn)為其同工酶表達(dá)不僅具有組織特異性，而且與積累量有關(guān)。而本研究沒有發(fā)現(xiàn)劑量梯度與EST同工酶表達(dá)的正相關(guān)變化。在不同染毒時間處理下，心臟和肌肉組織EST同工酶活性在24 h時先增強(qiáng)，而后一直呈減弱趨勢，至96 h時活性又有所增強(qiáng)。出現(xiàn)這種情況可能是乙烯利刺激了機(jī)體的應(yīng)激機(jī)制，機(jī)體通過增加EST酶帶數(shù)量來增加對抗異物入侵所需的能量，表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激性，但機(jī)體的應(yīng)激能力是有限的，當(dāng)超過其忍受限度時EST同工酶的表達(dá)被抑制，至96 h時EST同工酶活性又有所增強(qiáng)，表明機(jī)體對環(huán)境產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性；而脾臟、肝胰臟、鰓3種組織EST同工酶基本上在24 h時活性先增強(qiáng)，48 h時活性達(dá)到最弱，72 h時略有增強(qiáng)，96 h時又減弱，其可能原因與不同組織所執(zhí)行的生理功能有密切關(guān)系。

本試驗(yàn)研究了在外界環(huán)境下一定濃度的乙烯利對泥鰍不同組織EST同工酶的影響，乙烯利的濃度為0.06、0.07、0.08 mg/mL，其中0.06 mg/mL與0.08 mg/mL分別為預(yù)試驗(yàn)中泥鰍96 h全部存活與全部死亡的濃度，若要得出乙烯利在泥鰍體內(nèi)的限量，可采用體內(nèi)注射的方式進(jìn)一步研究EST活性變化。

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