金絲桃素抗雞球蟲效果觀察

摘要：為探明金絲桃素是否具有抗雞球蟲的作用，特進(jìn)行了金絲桃素體外抗球蟲孢子化試驗及體內(nèi)抗球蟲試驗。體外抗球蟲孢子化試驗結(jié)果表明，金絲桃素濃度達(dá)到0.03%即有明顯的抑制球蟲孢子化的作用；體內(nèi)抗球蟲試驗也表明金絲桃素具有抗雞球蟲的活性，服用金絲桃素6、8、10、12 mg/只，其抗球蟲指數(shù)分別為66.1、100.3、126.0、131.3。研究結(jié)果為拓展藥物資源應(yīng)用的新領(lǐng)域、研發(fā)抗球蟲新藥提供了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金絲桃素；雞球蟲?。–occidiosis in chicken）；孢子化

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4316—05

雞球蟲病 （Coccidiosis in chicken）是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病，是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病[1]。10～30日齡的雛雞或35～60日齡的青年雞的發(fā)病率和致死率可高達(dá)80%[2]。病愈的雛雞生長受阻，增重緩慢；成年雞一般不發(fā)病，但為帶蟲者，增重和產(chǎn)蛋能力降低，是傳播球蟲病的重要病源[3]。國內(nèi)外使用的抗雞球蟲藥物有化學(xué)合成和抗生素兩大類，現(xiàn)今廣泛使用的有20種。我國養(yǎng)雞生產(chǎn)上使用的抗球蟲藥品種共有十余種，如地克珠利、氯羥吡啶、磺胺氯丙嗪鈉、妥曲珠利、氨丙林、磺胺二甲基嘧啶等?，F(xiàn)階段使用的抗球蟲藥物大多必須嚴(yán)格控制用量，以免發(fā)生藥物中毒；如果單獨用藥則療效低，往往需要多種藥物聯(lián)合使用才能達(dá)到效果，因此使用起來不方便，而且具有嚴(yán)重的抗藥性[4]。

金絲桃素具有多種藥理作用[5—9]。在動物疾病防治方面，近年來也有很多的研究成果，如金絲桃素對高致病性的H5N1和H9N2亞型禽流感病毒有極強的殺滅作用[10]，對口蹄疫病毒也有良好的抑制作用[11]。

金絲桃素抗雞球蟲方面的研究尚未見報道，由于金絲桃素是一種天然產(chǎn)物，不會出現(xiàn)殘留，因此具有明顯的優(yōu)勢，該項研究可為雞場生產(chǎn)高品質(zhì)的產(chǎn)品提供保障，并為拓展藥物資源應(yīng)用的新領(lǐng)域、研發(fā)抗球蟲新藥提供良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料 40%金絲桃素（成都普瑞法公司）、磺胺氯吡嗪鈉（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工集團有限公司）、胃蛋白酶（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）。1日齡海蘭褐公雛雞126只由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院雞場提供，喂養(yǎng)至13日齡。肉雞飼料依照標(biāo)準(zhǔn)配制，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院雞場提供。

1.1.2 設(shè)備 電子天平 AB204—N （梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH—6（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司），LD4—2A 離心機（江蘇江陽科技器械廠），DHP060 恒溫培養(yǎng)箱 （上海實驗儀器廠有限公司），顯微鏡K3—210（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 雛雞的分組 將13日齡雛雞隨機分成7 組，其中4組口服金絲桃素，1組口服磺胺氯吡嗪鈉，另設(shè)攻蟲不給藥和不攻蟲空白對照各1組。具體分組情況見表1。

1.2.2 球蟲的分離及培養(yǎng) 收集患有柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）病雞（由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院寄生蟲病實驗室提供）的糞便，逐日糞檢，待到卵囊出現(xiàn)達(dá)高峰時，收集糞便，分離卵囊，加入2.5%重鉻酸鉀，28 ℃培養(yǎng)，讓其孢子化，保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 體外抗孢子化試驗

1）將按1.2.2方法收集的含卵囊液體（未培養(yǎng)）分成4組，每組含 2.4×106個卵囊，其中1組為空白對照組，其余3組為給藥組，金絲桃素按濃度梯度分為1組（0.01%）、2組（0.03%）、3組（0.05%）。用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，振蕩器上培養(yǎng)2 d。

2）記錄孢子化后球蟲卵囊數(shù)。將上述培養(yǎng)后液體用吸管吸取到16×25的細(xì)胞計數(shù)板上，放入顯微鏡下，在低倍鏡下觀察，記錄卵囊數(shù)（卵囊數(shù)/mL=100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/100×400×10 000×稀釋倍數(shù)）。將數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.2.4 體內(nèi)抗球蟲試驗

1）將金絲桃素制成堿水溶液，給藥組雛雞分別按每天6、8、10、12 mg/只的劑量連續(xù)給藥2 d（試驗期為8 d），口腔灌服；給藥的第1天同時經(jīng)口灌服接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×104個/只。

2）攻蟲不給藥組的雛雞，接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×104個/只，且不進(jìn)行任何治療。

3）磺胺藥給藥組每天在飲水中添加磺胺氯吡嗪鈉（0.3 g/L，試驗期連續(xù)給藥8 d），同時在給藥的第1天接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×104個/只。

4）臨床觀察各組雛雞8 d，隨時觀察和記錄動物的行為，外觀活動和糞便、體溫等情況。其中血便計分是在接種卵囊后第四至八天，參照Morehouse等[14]的方法按以下標(biāo)準(zhǔn)記分。0分：100%糞便不帶血；1分：1%～25%糞便帶血；2分：26%～50%糞便帶血；3分：51%～75%糞便帶血；4分：76%～100%糞便帶血。

5）試驗結(jié)束時，對所有雞進(jìn)行稱重、統(tǒng)計存活率、相對增重率，剖檢記錄盲腸病變值，盲腸內(nèi)容物稱重及卵囊數(shù)量檢測等。

病變計分：參照J(rèn)ohnson等[13]的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)剖檢后腸道病變的嚴(yán)重程度記分。病變值=每組平均病變記分×10。

克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)（OPG）計算：按照McMaster’s法計數(shù)。

卵囊值計算：根據(jù)盲腸內(nèi)容物的OPG值（每克盲腸內(nèi)容物中的卵囊數(shù)）按角田清方法換算卵囊值。

抗球蟲指數(shù)（ACI）計算：采用默克公司的標(biāo)準(zhǔn)計算抗球蟲指數(shù)?？骨蛳x指數(shù)（ACI）=（相對增重率+存活率）—（病變值+卵囊值）。抗球蟲效果判定：ACI值小于120不適于作為抗球蟲藥，ACI值120～160為有療效，160～180為療效中等，180以上為療效良好。

2 結(jié)果

2.1 體外孢子化試驗結(jié)果

通過體外試驗獲得孢子化率的數(shù)據(jù)見表2。由表2可見，第3組對球蟲孢子化抑制作用最大，其次是第2組，說明金絲桃素具有抗球蟲孢子化作用，而且隨著濃度的增加其作用加強。

2.2 體內(nèi)抗球蟲試驗結(jié)果

2.2.1 癥狀觀察及存活情況 試驗期間，給藥組的雛雞精神狀況良好，采食正常，只有少部分打蔫，排血便情況也較不給藥組要好，產(chǎn)生血便較晚，轉(zhuǎn)好相對較快。不給藥組雛雞精神沉郁，采食量減少，翅膀下垂、蓬松，泄殖腔周圍羽毛被糞便污染，閉目呆臥，繼而出現(xiàn)拉稀或者血便等現(xiàn)象。試驗結(jié)束時，金絲桃素給藥組雛雞存活率高，平均存活率73.3%；攻蟲不給藥組死亡16只，存活率僅為20.0%。金絲桃素各給藥組與攻蟲不給藥組存活率差異極顯著（P<0.01），說明金絲桃素確有抗球蟲的功效；金絲桃素給藥組與磺胺藥給藥組存活率差異也達(dá)極顯著（P<0.01），說明金絲桃素的這種給藥方式其藥效與磺胺類藥物相比還有差距（表3）。

2.2.2 血便計分 接種卵囊后第四至八天，參照Morehouse等[14]的方法記分，結(jié)果見表4。由表4可見，攻蟲不給藥組排血便情況明顯，病癥較重。在第四天出現(xiàn)死亡情況；給藥組排血便情況較不給藥組要輕，而且好轉(zhuǎn)較快。血便的情況與給藥濃度有關(guān)，隨著給藥濃度的提高，血便情況逐漸減輕。

2.2.3 體重變化 由表5可見，試驗前各組雛雞的平均體重為124.30 g/只，差異不顯著。試驗結(jié)束后，金絲桃素各給藥組的日增重均高于攻蟲不給藥組，且金絲桃素各給藥組末重均明顯高于攻蟲不給藥組。

2.2.4 盲腸變化及盲腸內(nèi)容物卵囊計數(shù) 對處理8 d的雛雞進(jìn)行剖檢，按照病變計分標(biāo)準(zhǔn)對盲腸的變化進(jìn)行記錄打分，結(jié)果見表6。由表6可見，攻蟲不給藥組，金絲桃素6、8、10、12 mg/只給藥組，磺胺藥給藥組及空白對照組病變值分別為28、27、25、20、20、10、0。對盲腸內(nèi)容物的卵囊數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果攻蟲不給藥組為0.877×106個/g，金絲桃素6、8、10、12 mg/只給藥組分別為0.753×106、0.726×106、0.537×106、0.492×106個/g，磺胺藥給藥組為0.262×106個/g，空白對照組為0。相應(yīng)的卵囊值除空白對照組為0外，其他各組均為1。病變值和盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)均隨金絲桃素給藥濃度的增加而下降，說明金絲桃素對雞球蟲有抑制，從而對盲腸有一定的保護(hù)作用，降低了其損傷程度。

由表6可見，金絲桃素抗球蟲指數(shù)在10 mg/只給藥組和12 mg/只給藥組均達(dá)120以上，可判定為有療效，而磺胺藥給藥組抗球蟲指數(shù)達(dá)177.3，屬于療效中等，所以金絲桃素給藥組的療效尚不及磺胺藥給藥組。但金絲桃素各給藥組均比攻蟲不給藥組抗球蟲指數(shù)明顯提高，表明金絲桃素有抗雞球蟲的活性。

3 討論

3.1 中草藥治療雞球蟲病的效果

我國獸醫(yī)科技工作者在應(yīng)用中草藥治療雞球蟲病方面積累了大量的臨床經(jīng)驗，已取得了可喜的成績。越來越多的中草藥被證實對球蟲病有一定的療效，如含有常山堿、常山酮的常山對自然感染球蟲的病雞和人工感染柔嫩艾美耳球蟲病雞具有顯著的療效。目前，使用中草藥防治雞球蟲病有單方、復(fù)方和提取物三種形式。

單味藥如常山、苦參、野菊花、丁香葉、蛹蟲草、地墨、白頭翁、鴨膽子、大蒜、青蒿等具有抗球蟲作用，可單獨或作復(fù)方制劑的主藥使用，其所含生物堿是抗球蟲的主要成分。趙愛蓮等[15]用蛹蟲草治療人工感染的雞球蟲病，抗球蟲指數(shù)達(dá)174，抗蟲效果比咪唑苯脲及氯苯胍好。劉其容[16]用常山加水煎汁拌料150 g/L喂患病雞，嚴(yán)重者用滴管灌服，用藥3 d后血便基本停止，球蟲病得到控制。

提取有效成分治療雞球蟲病。陳蒲丹等[17]研究表明，青蒿及其提取物體外能有效抑制球蟲卵囊孢子化，青蒿注射液和青蒿顆粒劑的抗球蟲指數(shù)分別為164.69和155.86，能有效地提高感染雞的成活率和相對增重率，并能減輕球蟲感染引起的盲腸病變，減少血便，具有較好的抗球蟲效果。國外也有用中藥提取物抗球蟲的試驗，Youn等[18]用包括苦參、白頭翁、柴胡在內(nèi)的15種中藥的提取物進(jìn)行抗球蟲病的試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)竊衣、苦參提取物治療組存活率最高，大果榆、朝鮮白頭翁提取物治療組的病變較小，使君子提取物治療組的增重明顯，而槐樹、苦參提取物治療組的血便嚴(yán)重。

金絲桃素是一種二蒽酮類化合物，主要分布在貫葉連翹等金絲桃屬植物體內(nèi)，具有多種生物活性。金絲桃素在體內(nèi)、體外均有抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用，具有極強的抗病毒效果，對艾滋病毒早期復(fù)制有較強的抑制作用。能引起癌細(xì)胞程序性的死亡，具有抗癌作用。能激活單核吞噬細(xì)胞等，具有增強免疫的作用。由于金絲桃素具有抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁等作用，特別是顯著的抗HIV病毒活性，因此引起人們密切關(guān)注[7]。

用金絲桃素防治雞球蟲病的研究未見報道，從本研究結(jié)果看，金絲桃素具有較強的抗球蟲效果，與其他中草藥比較療效差異不大，但和常用的磺胺類藥物比較，療效還有一定的差異。雖然目前抗球蟲指數(shù)還不是很高，筆者認(rèn)為主要可能由于對金絲桃素抗球蟲的機理尚未完全了解，對金絲桃素體內(nèi)代謝、作用過程不清，所以對藥物使用的劑量及劑型的合理性還缺乏深入理解，如目前使用的堿水溶液就不一定是一個高效的劑型。相信如果解決了這些問題，將會大大提高其抗球蟲的效果。

本試驗使用磺胺類藥物作為對照，主要考慮它的使用比較普遍，對于結(jié)果的判定具有一定的參考價值。

3.2 中草藥抗雞球蟲的機理

目前對中藥抗雞球蟲的機理研究不多，主要是在抑制球蟲孢子化和影響血液指標(biāo)兩方面做了些工作。雞球蟲病的感染都是由易感染雞經(jīng)口攝取球蟲卵囊而引發(fā)的。其卵囊只有在孢子化后被雞吞食才會致病。因此如果在體外減少雞球蟲卵囊的孢子化，即可降低球蟲病的感染率。

李玉蘭等[19]對影響柔嫩艾美耳球蟲卵囊孢子化的因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)高溫、低溫、強光均可以降低孢子化的比率，而溶液的性質(zhì)也可以影響孢子化過程。

中藥“球康” （中藥復(fù)方制劑）2%和5%濃度分別作用1、5、10 h均可以使球蟲卵囊的孢子化率明顯降低，其中2%濃度作用10 h組和5%濃度作用5、10 h組的孢子化率與2.5%重鉻酸鉀對照組差異極顯著（P<0.01），中藥“球康”5%濃度作用10 h對球蟲的孢子化率的抑制作用最強，到第六天時，其孢子化率僅為61.05%。這說明中藥“球康”可以抑制球蟲卵囊的孢子化過程。在相同濃度下，隨藥物作用時間的延長，球蟲的孢子化率降低；在相同的作用時間下則隨著藥物濃度的提高而提高[20]。

使用不同濃度川楝子、青蒿、珍珠草和蒸餾水（空白對照），每試驗組均3個重復(fù)，分別作用未孢子化柔嫩艾美耳球蟲卵囊后在不同時間測定其孢子化率。結(jié)果顯示，除珍珠草組外其余各組在12 h均出現(xiàn)孢子化，珍珠草1.0 g/mL、0.5 g/mL作用36 h以內(nèi)孢子化率均為0；珍珠草0.25 g/mL作用18 h孢子化率為1.71%，而空白對照組已達(dá)85%以上。由此表明珍珠草具有很強的抑制雞球蟲卵囊孢子化的作用[21]。

本試驗中使用不同濃度的金絲桃素進(jìn)行的體外抑制球蟲卵囊孢子化試驗結(jié)果也表明金絲桃素具有顯著的抑制雞球蟲卵囊孢子化的作用，推測其抗球蟲的主要途徑可能是通過抑制卵囊孢子化過程完成的。但具體抑制機理及如何影響卵囊孢子的代謝途徑等尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林 毅，馮澤光. 雛雞實驗感染柔嫩艾美爾球蟲的病理學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1993（5）：64—69.

[2] 張志文.1998年世界主要國家畜牧生產(chǎn)統(tǒng)計資料[J].中國畜牧雜志，2000（1）：57—62.

[3] 譚 晨.幾種常見抗球蟲藥引起的雞中毒性疾病[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2003（7）：10.

[4] 甘德培.抗球蟲藥與球蟲的抗藥性研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，1999，7（2）：53—56.

[5] 項光亞，楊 瑜，阮金蘭，等.金絲桃化學(xué)成分研究[J].同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，30（5）：431—433.

[6] 崔 穎，梁劍平，王學(xué)紅，等， RP—HPLC測定貫葉連翹中的金絲桃素含量[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2005，26（9）：43—45.

[7] 曲曉波，蘇忠民，胡冬華，等.金絲桃素分子結(jié)構(gòu)及其與HIV病毒蛋白酶作用的分子動力學(xué)研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2009， 30（7）：1402—1405.

[8] 趙曉虹. 金絲桃素新制劑在體外抗HIV的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[9] 葉春苗，王淑琴，趙春燕.金絲桃素的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007（1）：28—29.

[10] 李 新.金絲桃素對高致病性禽流感病毒殺滅效果良好[J].中國家禽，2005，27（2）：49.

[11] 王曙陽，梁劍平，楊林西，等，金絲桃素對口蹄疫病毒的體外抗病毒實驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2006，42（6）：6—9.

[12] 顧有方，陶愛香，康 健，等，堆型艾美耳球蟲卵囊的分離與純化[J].安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報，2003（1）：1—3.

[13] JOHNSON J，REID W M. Anticoccidial drugs：lesin scoring techniques in battery and floor—pen experiments with chickens [J]. Exp Parasitol，1970，28（1）：30—36.

[14] MOREHOUSE N F， BARON R R. Coccidiosis：Evaluation of coccidiostats by mortality， weight gains ，and fecal score[J]. Experimental Parasitology，1970，28（1）：25—29.

[15] 趙愛蓮，趙振升，張深固，等.蛹蟲草等抗雛雞脆弱艾美耳球蟲的作用[J].中國獸藥雜志，1992，26（3）：40—42.

[16] 劉其容.常山治雛雞球蟲病[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1985（1）：17.

[17] 陳蒲丹，劉 娟.青蒿及其提取物對雞柔嫩艾美耳球蟲的抑制作用[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008（2）：24—26.

[18] YOUN H J， NOH J W. Screening of the anticoccidal effects of herb extracts against Eimeria tenella[J]. Veterinary Parasitology，2001， 96（4）：257—263.

[19] 李玉蘭，張龍現(xiàn)，寧長申，等.影響雞球蟲未孢子化卵囊及孢子化卵囊活性因素的探討[J].中國獸醫(yī)雜志，1998，24（2）：17.

[20] 周作勇，王芝英，聶 奎.中藥“球康”對柔嫩艾美耳球蟲孢子化率和孢子化卵囊的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（17）：146—147.

[21] 孟新宇.珍珠草對E. tenella卵囊孢子化率、脫囊率及致病力的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.