煙草土壤微生物與土壤酶活性分析

摘要：從湖北省恩施咸豐縣煙田采集煙草（Nicotiana tabacum L.）不同生長時期的土壤樣品，采用稀釋平板涂布法進行細菌、放線菌、氨化細菌、硝化細菌、真菌的分離并對土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、過氧化氫酶進行酶活性的測定。試驗結(jié)果表明，①土壤中氨化細菌數(shù)量最多，真菌數(shù)量最少。各種類群微生物在煙草整個生育期間變化波動較大，不同類群微生物消長趨勢不同，整體呈上升趨勢；其中，煙草生長旺盛期微生物數(shù)量最多。②在煙草生長前期，土壤脲酶活性較高；磷酸酶活性在前、中期均處于比較高的水平；在后期，隨著土壤熟化程度的提高，蔗糖酶活性增強較明顯；過氧化氫酶活性在各個時期的變化較平穩(wěn)。

關(guān)鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum L.）；土壤微生物；土壤酶活性

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4229—04

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種特殊的葉用經(jīng)濟作物，其生長發(fā)育和質(zhì)量形成與土壤生物學特性和生態(tài)環(huán)境有著密切的關(guān)系。土壤微生物是土壤的重要組成部分，它對土壤肥力的形成和植物營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化起著積極的作用[1]。土壤微生物種類、數(shù)量可以作為評價土壤肥力的指標[2]。土壤酶活性與土壤微生物類群密切相關(guān)，土壤酶活性反映了土壤微生物群落的代謝狀況。土壤微生物和土壤酶既是土壤有機物轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是植物營養(yǎng)元素的活性庫[3]。此外，酶是土壤組分中最活躍的有機成分之一，土壤酶活性反應(yīng)了土壤的生物學活性。研究煙草土壤中微生物類群和數(shù)量以及土壤酶活性隨著煙草不同生長時期的變化動態(tài)有助于分析影響煙草生長發(fā)育的土壤生態(tài)因子。本試驗對湖北省恩施咸豐縣煙田不同生長時期的土壤微生物進行分離，并對土壤酶活性進行測定，分析了土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性在煙草不同時期的差異和變化動態(tài)，探索土壤微生物、酶活與煙草生長的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品采自湖北省恩施咸豐縣高樂山鎮(zhèn)小模村煙田。土壤類型為黃棕壤，質(zhì)地疏松，通透性好。年平均氣溫15～17 ℃，年降水量為1 300～1 500 mm，相對濕度80%。栽培煙草品種為云煙87，使用肥料為烤煙專用復合肥。供試細菌、放線菌、真菌、氨化細菌、硝化細菌所用培養(yǎng)基分別為LB培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、蛋白胨氨化培養(yǎng)基、硝化細菌培養(yǎng)基。供試儀器為720型分光光度計、恒溫培養(yǎng)搖床、恒溫培養(yǎng)箱。供試試劑為0.3%過氧化氫、3，5—二硝基水楊酸、蔗糖、磷酸苯二鈉、4—氨基安替吡啉、鉀鋁礬等。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣方法 分別在煙草施用基肥前1 d（移栽前）、移栽當天，移栽后15、30、45、60、75、90 d和采收完畢后采集土樣，共9次。挖取煙株之間壟上土壤耕層0～20 cm表層、中層和底層的土壤，混勻，用保鮮袋裝好，貼好標簽。

1.2.2 樣品處理 土樣采回后立即對土壤微生物進行分離。用于土壤酶活性測定的土樣及時風干、過篩，放置于室溫保存。

1.2.3 測定方法

1）土壤微生物的分離及數(shù)量測定。采用稀釋涂布平板法進行土壤微生物的分離[4，5]。稱取10 g土壤樣品，放入90 mL無菌水中，攪拌均勻。將土壤懸液進行10倍系列梯度（10—3、10—4、10—5、10—6、10—7）稀釋，吸取不同稀釋濃度的土壤懸液進行各種微生物的分離。將分離培養(yǎng)的細菌放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；放線菌放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；氨化細菌放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d；硝化細菌放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；真菌放入28 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。菌落數(shù)量采用平板菌落計數(shù)法，每個稀釋度做3次重復。計算公式：微生物數(shù)量（CFU/g）=同一稀釋度3次重復平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

2）蔗糖酶活性的測定。采用3，5—二硝基水楊酸比色法[6，7]。以蔗糖為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物葡萄糖與3，5—二硝基水楊酸生成有色化合物3—氨基—5—硝基水楊酸的量進行比色測定。同時做標準曲線、無基質(zhì)對照和無土壤對照試驗。蔗糖酶活性（mg/g）以24 h后每克土樣所產(chǎn)生葡萄糖的質(zhì)量來表示。

3）脲酶活性的測定。采用比色法[6，7]。以尿素為基質(zhì)，酶促水解后生成的氨在強堿性溶液中與苯酚鈉及次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚，以其生成數(shù)量與氨濃度成正比來進行定量分析。同時做標準曲線、無基質(zhì)對照和無土壤對照試驗。土壤脲酶活性（mg/100 g）以100 g土中NH3—N的含量表示。

4）磷酸酶活性的測定。采用磷酸苯二鈉比色法。其原理是磷酸苯二鈉作為基質(zhì)被土壤磷酸酶水解后生成酚，測定酚的質(zhì)量即可確定磷酸酶的活性[6，7]。磷酸酶活性（mg/g）以每克風干土壤中的酚含量來表示。

5）過氧化氫酶活性的測定。采用紫外分光光度計法[8]?；谶^氧化氫酶能酶促過氧化氫分解生成水和氧氣，通過加入等量過量的過氧化氫與土壤作用一段時間，加入量與剩余量之差即為被酶催化反應(yīng)消耗的過氧化氫，以此表示酶活性。過氧化氫在240 nm處有強烈吸收，通過測定與土壤反應(yīng)后溶液在此波長下的吸光度，即可得到溶液中過氧化氫的濃度，計算酶的活性。過氧化氫酶的活性（mg/g）用每20 min內(nèi)每克土壤分解的過氧化氫的量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物數(shù)量的變化

從試驗結(jié)果（表1）可見，土壤中氨化細菌數(shù)量最多，真菌數(shù)量最少。煙草生長中期（移栽后45 d）土壤微生物數(shù)量最多，達到了4.7×107 CFU/g，早期（移栽當天）和末期（采收后）土壤微生物數(shù)量較少，說明煙草生長旺盛期土壤具有豐富的微生物。移栽前微生物數(shù)量較多，而移栽時數(shù)量減少，這可能是由于施肥、翻土等農(nóng)事操作對土壤中微生物的生長環(huán)境影響較大。

不同種類的微生物數(shù)量在煙草不同生育期的變化趨勢不同。其中，土壤中細菌數(shù)量移栽前最多，達4.2×106 CFU/g土，移栽當天數(shù)量急劇下降。在煙草生長前期土壤中細菌數(shù)量（移栽當天至移栽后30 d）變化較小、中期（移栽后45 d）明顯上升，移栽后60 d又明顯下降，之后一直呈上升趨勢。土壤中真菌數(shù)量除早期（移栽時）較少外，其余時期均較多，尤其是中、后期真菌數(shù)量最多。土壤中放線菌數(shù)量在生長前、中期數(shù)量較多，后期數(shù)量明顯上升，移栽后90 d達到最高值，為2.2×106 CFU/g 土。土壤中硝化細菌數(shù)量變化不明顯，在生長中、后期有緩慢增加的趨勢。土壤中氨化細菌數(shù)量隨著時間的推移變化幅度比較大，在煙草不同生長時期出現(xiàn)兩次高峰，分別是移栽后15 d和45 d，在煙草生長后期氨化細菌數(shù)量也較多。

2.2 土壤酶活性的變化

2.2.1 蔗糖酶活性 蔗糖酶能酶促蔗糖水解成葡萄糖和果糖。隨著土壤熟化程度的提高，蔗糖酶的活性亦增強。常用土壤蔗糖酶活性表征土壤的熟化程度和肥力水平。土壤中蔗糖酶活性在前期（移栽前至移栽后15 d）緩慢下降；移栽后30～60 d蔗糖酶活性較低，移栽后75 d蔗糖酶活性顯著上升，移栽后90 d蔗糖酶活性最高，為11.49 mg/g（圖1）。表明在后期，隨著土壤熟化程度的提高，蔗糖酶活性增強較明顯。

2.2.2 脲酶活性 脲酶是一種酰胺酶，能酶促有機質(zhì)分子中肽鍵的水解。土壤中脲酶活性在前期變化較大，在移栽后15 d上升至最高值，為538.89 mg/100 g土，此后脲酶活性下降至較低水平，后期脲酶活性又緩慢上升（圖2）。

2.2.3 磷酸酶活性 土壤中磷酸酶活性在前、中期（移栽前至移栽后60 d）均處于比較高的水平；移栽后60 d磷酸酶活性最高，為26.34 mg/g ；移栽后75 d磷酸酶活性急劇下降；此后，磷酸酶活性上升至之前水平（圖3）?？傮w來說，土壤磷酸酶活性較高。

2.2.4 過氧化氫酶活性 土壤中過氧化氫酶活性在各個時期變化較平穩(wěn)，移栽前酶活最高，為0.99 mg/g；此后過氧化氫酶活性緩慢下降，在中、后期（移栽后45 d至采收完畢）酶活變化不明顯（圖4）。土壤過氧化氫酶的活性代表了土壤的呼吸強度，表明土壤呼吸強度較穩(wěn)定，在煙草的整個生育期變化不明顯。

3 小結(jié)與討論

3.1 土壤微生物在煙草不同生長時期的變化

煙草根際土壤中氨化細菌數(shù)量最多，真菌數(shù)量最少。煙草生長中期（移栽后45 d）土壤微生物數(shù)量最多，早期（移栽當天）和末期（采收后）土壤微生物數(shù)量最少，說明煙草生長旺盛期土壤微生物類群豐富，種群數(shù)量大。

土壤中各種類群微生物在整個生育期間變化波動較大，不同類群微生物消長趨勢不同，整體呈上升趨勢。放線菌數(shù)量在生長前、中期數(shù)量較多，后期數(shù)量明顯上升。土壤中的放線菌多數(shù)可產(chǎn)生抗生素，拮抗土壤中的病原菌，煙草根際土壤中放線菌數(shù)量在煙草生長后期增加將有益于防治煙草病害。土壤中的氨或銨鹽在硝化細菌（亞硝酸細菌、硝酸細菌）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}，NO3—N是作物良好的有效態(tài)養(yǎng)分，增加了植物可利用的氮素營養(yǎng)，土壤中硝化細菌的活動可提高土壤肥力[6]。土壤中硝化細菌數(shù)量在煙草生長中、后期增加，可促進煙草對氮肥的吸收利用。土壤中含氮的有機物在氨化細菌作用下分解釋放出氨，氨與土壤中的酸根結(jié)合成銨鹽，再經(jīng)硝化細菌的作用轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，增強土壤肥力。氨化細菌數(shù)量與土壤肥力成正相關(guān)，土壤中氨化細菌數(shù)量在煙草生長中、后期較多，可促進土壤肥力及煙草的生長。

3.2 土壤酶活性在煙草不同生長時期的變化

土壤中不同種類酶活在煙草不同生長時期變化趨勢不同，煙草生長前期的脲酶、過氧化氫酶、磷酸酶活性較高。土壤中脲酶活性可用于表征土壤中的氮素狀況，土壤中脲酶活性在煙草生長早期較高將有利于氮元素的吸收和利用。磷酸酶能促進有機磷化合物的水解，表征土壤磷的肥力狀況。磷酸酶活性在前、中期均處于比較高的水平，表明土壤磷的肥力良好。隨著土壤熟化程度的提高，后期蔗糖酶活性增強較明顯。

參考文獻：

[1] 杜秉海，李貽學，宋國菡，等.煙田土壤微生物區(qū)系分析[J].中國煙草科學，1996（2）：30—32.

[2] 許景偉，王衛(wèi)東，李 成.不同類型黑松混交林土壤微生物、酶及其與土壤養(yǎng)分關(guān)系的研究[J].北京林業(yè)大學學報，2000，22（1）：51—55.

[3] 李倩茹，符夏梨.紅樹林土壤微生物與土壤酶活性分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2009（7）：93—96.

[4] 李振高，駱永明，滕 應(yīng).土壤與環(huán)境微生物研究法[M].北京：科學出版社，2008.

[5] 黃 玨.硝化細菌的分離鑒定[J].水產(chǎn)科技情報，2004，31（3）：130—134.

[6] 關(guān)松萌.土壤酶及其研究法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[7] 周禮愷.土壤酶學[M].北京：科學出版社， 1987.254—260.

[8] 楊蘭芳，曾 巧，李海波，等.紫外分光光度法測定土壤過氧化氫酶活性[J].土壤通報，2011，42（1）：207—210.

[9] 陳紅軍，孟 虎，陳鈞鴻.兩種生物農(nóng)藥對土壤蔗糖酶活性的影響[J].生態(tài)環(huán)境，2008，17（2）：584—588.