鋅指核酸酶技術在動物轉基因中的應用

摘要：鋅指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）具有特異性識別并敲除ＤＮＡ片段中特定基因的特點，通過對ＤＮＡ片段上的特定基因進行靶向修飾產生新型細胞，是能夠應用于動物轉基因上的一種新技術。該技術已在一些動物的研究上取得了一定的成果，相對于傳統(tǒng)的轉基因技術，該技術在簡化操作程序、縮短操作時間及提升成功率上都有很大的提高。就常用的動物轉基因方法、鋅指核酸酶技術的作用原理以及在動物轉基因上的應用及其前景進行了論述。

關鍵詞：鋅指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）；動物轉基因；靶向修飾

中圖分類號：Ｑ７８９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）19－4177-04

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ

ＷＡＮＧ Ｌｉｕ－ｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｊｉ－ｔｉａｎ，ＹＵ Ｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｂｉｎｇ

（Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

動物的轉基因技術是建立在分子生物學基礎上，利用基因工程等試驗方法將外源基因導入動物的受體細胞，并通過受體細胞的分裂與繁殖，將整合在受體細胞基因組中的目的基因有效遺傳給后代個體，并得到預期結果的一種方法。該技術始于２０世紀８０年代，１９８０年Ｇｏｒｄｏｎ等［１］通過核顯微注射技術在小鼠體內的試驗，成功獲得了第一個轉基因動物。后來一些研究人員又利用該方法陸續(xù)在兔、綿羊、豬的轉基因上獲得成功，在此基礎上人們通過不斷試驗探索出其他的轉基因技術，并且也在一些動物的轉基因上獲得成功。如逆轉錄病毒載體法、精子載體法、胚胎干細胞介導法等分別在牛、雞、小鼠等動物的轉基因上獲得成功。但是，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，研究人員對轉基因結果的要求也越來越高，而這些傳統(tǒng)的技術在一定程度上已不能滿足人們的要求。為了得到更好、更符合人們意愿的試驗結果，研究人員不斷地探索著更為先進的轉基因技術，鋅指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）技術就是一種新的轉基因技術，由于其具有獨特的剪切功能而引起了研究人員的極大興趣。１９８６年Ｄｉａｋｕｎ等［２］首先在真核生物轉錄因子家族的ＤＮＡ結合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２鋅指模塊，到１９９６年Ｋｉｍ等［３］人工合成了第一個ＺＦＮ，再到Ｕｒｎｏｖ等［４］發(fā)現(xiàn)的由４個鋅指連接而成的ＺＦＮ可識別２４ ｂｐ的特異性序列，ＺＦＮ在轉基因中的作用逐漸受到了研究人員的關注。

１ 動物轉基因技術的常用方法

１．１ 逆轉錄病毒載體法

逆轉錄病毒載體法是利用病毒作為載體，將外源基因片段插入病毒載體的長末端重復序列的下游并通過其侵染作用將目的片段整合到宿主細胞的基因組中。該方法主要應用于轉基因雞和牛的生產。１９７４年Ｊａｎｅｎｉｓｃｈ等［５］發(fā)現(xiàn)注入小鼠囊胚腔中的ＳＶ４０ＤＮＡ能夠在其體內發(fā)生整合。但真正用于轉基因動物的則是Ｓａｌｔｅｒ等［６］研究人員，他們在１９８７年利用該方法生產出了轉基因雞；而Ｂｉｅｒｙ等［７］則在１９９５年以勞式肉瘤病毒（ＲＳＶ）為載體，通過將目的基因片段導入牛的胚胎，獲得了轉基因牛。此方法操作簡便，整合效率高且整合的外源基因多為單拷貝，所以非常有利于對基因結構、功能及表達調控的研究［８］。

１．２ 精子載體法

精子載體法是通過將外源ＤＮＡ與精子混合培養(yǎng)后，利用帶有外源ＤＮＡ的精子與卵細胞結合形成受精卵，然后將該受精卵通過胚胎移植轉移到動物的子宮內，經過發(fā)育后形成轉基因動物［９］。１９８９年Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等［１０］利用該方法生產出了轉基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠體內的外源ＤＮＡ能夠遺傳給后代。他們的這一結果引起了其他研究人員的關注。該方法雖然操作簡便，但其整合率低，需要通過改進來提高成功率。Ｓｑｕｉｒｅｓ等［１１］在該方法的基礎上利用脂質體包埋外源ＤＮＡ的方法成功地獲得了轉基因雞；Ａｎｔｈｏｎｙ等［１２］首先將精子的細胞膜破壞掉后再與外源ＤＮＡ混合培養(yǎng)，然后將帶有外源ＤＮＡ的精子注入小鼠處于減數(shù)分裂中期的卵母細胞內，提高了轉基因小鼠的數(shù)量。

１．３ 胚胎干細胞法

胚胎干細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＥＳ細胞）來源于早期的胚胎細胞，由于其具有高度未分化的特性，隨著生命體的發(fā)育它可以分化為多種細胞類型［１３］。該方法主要是在體外通過同源重組的方法將外源ＤＮＡ片段整合到ＥＳ細胞的基因組中，然后再將ＥＳ細胞轉移到動物的囊胚中，通過在動物體內的發(fā)育和分化，最終可以得到轉基因的個體。ＥＳ細胞由于其具有未分化的特點，所以其在轉基因動物研究中是研究人員非常青睞的一種受體細胞。但是ＥＳ細胞不能夠從許多動物體內分離出來，當前只有在小鼠的研究中比較成功，所以對于其他動物來說還需要進行進一步的研究。

１．４ 體細胞核移植法

體細胞核移植法是將體細胞移入去核卵母細胞中，使其重組并能發(fā)育成新的胚胎，這個胚胎最終發(fā)育成動物個體。其過程為：①細胞核的采集和卵母細胞的準備；②細胞促融；③植入代孕母體。１９９７年英國ＰＰＬ公司羅斯林研究所首次利用這種方法獲得克隆羊Ｄｏｌｌｙ。２年后，ＰＰＬ公司又利用這一技術獲得２只定點整合的轉基因羊。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等［１４］利用普通母羊的卵細胞與轉基因獲得的公羊的精子在體外人工受精后，將其細胞核轉移到去核的胎兒成纖維細胞中，最終獲得３只轉基因奶山羊。目前，該方法已經在轉基因羊、轉基因鼠、轉基因牛、轉基因豬上獲得成功。體細胞核移植法是將改造后的體細胞進行核移植，從而能夠提高轉基因的成功率。此外，該技術也可用于促進優(yōu)良種群繁育，生產珍貴的醫(yī)用蛋白，克隆動物的組織、器官移植的供體等，并且還可以對珍稀瀕危動物進行克隆繁殖。

１．５ 轉座子介導法

轉座子是一段能夠在生物體的基因組中自主復制并移動的ＤＮＡ片段，在經過切割、重組等過程后可以插入其他位點，并且能夠對插入位點之后的基因產生一定的影響。其突出代表是Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）和ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）。ＳＢ是通過對來自不同魚類基因組的有缺陷的拷貝序列比對，獲得最原始的轉座子序列，通過點突變獲得有活性轉座子元件［１５］。１９９７年Ｉｖｉｃｓ等［１６］首次在哺乳動物的細胞中發(fā)現(xiàn)存在著有轉座活性的ＤＮＡ轉座子。ＰＢ則來源于鱗翅目昆蟲。１９９８年Ｈａｎｄｌｅｒ等［１７］首次利用ＰＢ轉座子構建載體－輔助質粒雙轉化系統(tǒng)并成功轉化地中海實蠅，轉化頻率達到３％～５％。對ＰＢ插入位點的分析發(fā)現(xiàn)，ＰＢ在地中海實蠅基因組中特異性插入ＴＴＡＡ位點，并形成該靶位點重復，進一步證明了地中海實蠅種系轉化是由ＰＢ介導的染色體轉座子引起的。轉座子介導法具有高整合率、大承載量及更加容易找到整合位點等優(yōu)勢。

２ 鋅指核酸酶的結構及作用原理

ＺＦＮ是一種能夠定點識別ＤＮＡ雙鏈位置并進行酶切的重組蛋白。它主要是由兩部分組成，一部分是ＤＮＡ識別域，另一部分則是非特異性核酸內切酶。其中ＤＮＡ識別域通常是由３～４個Ｃ２Ｈ２結構的鋅指蛋白構成［１８］，鋅指蛋白是在真核生物體內普遍存在的具有特異性識別功能的蛋白，它主要是由轉錄調控因子家族（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ）形成，每個鋅指蛋白都能夠識別一個特定的三聯(lián)體堿基，當多個鋅指蛋白結合在一起后能夠形成一條含有特異性堿基的ＤＮＡ片段，該片段具有特異識別功能，并且適當改變ＤＮＡ結合特異性的氨基酸可以獲得新的ＤＮＡ結合特異性［１９］；而與ＤＮＡ識別域相連的是一種來自海床黃桿菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ）的限制性內切酶——ＦｏｋⅠ，它并不具有特異性識別位點并且也只有在二聚體狀態(tài)時才具有酶切活性［２０］。ＦｏｋⅠ單體只具有非特異性的剪切功能，只能隨機地切割ＤＮＡ雙鏈，當它與鋅指蛋白結合形成一個ＺＦＮ后才能夠識別特定的基因位點，而且只有當兩個識別位點距離較近時（６～８ ｂｐ），ＺＦＮ才能夠相互作用并具有定點的酶切功能。

ＺＦＮ是高效動物基因組位點特異性修飾酶，能夠使動物細胞內的ＤＮＡ在特定的位置發(fā)生雙鏈斷裂（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢ），ＤＳＢ能夠啟動細胞內的２種ＤＮＡ損傷修復機制：同源重組（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ，ＨＲ）和非同源末端連接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）。一方面因為ＤＳＢ可使得同源重組效率大大提高，如果細胞內同時存在與靶位點同源的ＤＮＡ片段，則細胞主要通過ＤＮＡ同源重組的機制修復ＤＳＢ，從而實現(xiàn)靶基因敲除或敲入；另一方面通過錯配率很高的ＮＨＥＪ的修復機制，在ＺＦＮ靶位點造成隨機性的小片段丟失或是插入，引起基因的靶向敲除［２１］。

３ 鋅指核酸酶在動物轉基因上的應用

動物的轉基因技術是通過對動物細胞內ＤＮＡ序列上的基因修飾來實現(xiàn)的，對基因的修飾既可以是隨機的，也可以是靶向的。ＺＦＮ技術就是一種基于基因靶向修飾的新技術，它已經被應用于不同物種的基因操作，且取得了很大的成功。目前，ＺＦＮ已分別在動物的細胞水平和整體水平實現(xiàn)了基因的定向修飾。

首先研究人員在動物的細胞水平利用ＺＦＮ技術實現(xiàn)了基因定向修飾。Ｓａｎｔｉａｇｏ等［２２］在中國倉鼠卵巢細胞（ＣＨＯ細胞）中暫時性表達針對ＤＨＦＲ基因序列的ＺＦＮ，造成１５％的ＣＨＯ細胞的ＤＨＦＲ位點特異性突變；Ｂｉｂｉｋｏｖａ等［２３］設計了１對三鋅指結構域的ＺＦＮ，用于識別位于果蠅Ｘ性染色體的ｙｅｌｌｏｗ基因第二外顯子。轉染ＺＦＮ到果蠅胚胎中，ＺＦＮ引發(fā)了靶位點的斷裂，細胞發(fā)生了ＮＨＥＪ，導致一半的雄性果蠅發(fā)生突變，在這些果蠅中有５．７％的個體恢復了正常顏色，其他的突變導致了顏色的改變。

接著研究人員實現(xiàn)了ＺＦＮ在整體水平的定向基因修飾，通過胚胎注射含有ＺＦＮ的質?；蚴牵恚遥危量梢杂行У囟ò校杆僭趥€體胚胎的內源基因上引起可遺傳的突變。Ｂｅｕｍｅｒ等［２４］利用ＺＦＮ技術將外源ＤＮＡ片段導入果蠅體內，使其與果蠅基因組的靶基因發(fā)生同源重組，發(fā)現(xiàn)在果蠅的子代中有超過１％的出現(xiàn)了基因重組；Ｄｏｙｏｎ等［２５］和Ｍｅｎｇ等［２６］在研究斑馬魚時發(fā)現(xiàn)，通過ＺＦＮ技術介導的基因突變，有３０％～５０％的個體將這種突變遺傳給子代，而子代中個體為突變型的則是７％～１８％，然而如果利用該技術作用于正常的胚胎，則其介導的基因打靶事件的成功率為９９％。２００９年Ｇｅｕｒｔｓ等［２７］在研究大鼠的遺傳變異時，利用ＺＦＮ技術通過基因的靶向修飾敲除了大鼠體內自身的２個基因片段以及之前插入的１個基因片段，并且在去除這些基因的同時對其他基因也并未產生較大的影響，結果發(fā)現(xiàn)在親代大鼠喪失某些功能的同時，其子代也出現(xiàn)了同樣的癥狀，這表明由該技術產生的基因突變能夠完全遺傳給后代，因此研究人員認為如果利用ＺＦＮ技術作用于動物的胚胎，則能夠很容易地在整個生物體內產生可遺傳的變異。目前，研究人員在小鼠、雞、牛等的轉基因研究中都發(fā)現(xiàn)了一些相對簡便的方法，而在大鼠及其他一些動物的轉基因研究中還沒有發(fā)現(xiàn)相對簡便有效的方法來對其體內的基因進行靶向修飾，因此應進一步了解其自身一些特定基因的功能。該研究發(fā)現(xiàn)ＺＦＮ不僅在技術上相對于傳統(tǒng)的轉基因操作簡便，而且還能夠在更短的時間內培育出轉基因動物。在試驗中，利用ＺＦＮ技術對大鼠模型的靶基因敲除只需４個月時間，而使用傳統(tǒng)的胚胎干細胞方法則是其３倍的時間。另外，該技術在大鼠中的成功應用，不僅為研究人員在更短的時間內開發(fā)其他轉基因動物奠定了一定的基礎，也為開展人類疾病的研究進行了較好的鋪墊。因此，ＺＦＮ在縮短研究時間、提高研究效率上是一種非常理想的轉基因技術。

４ 展望

轉基因技術本身就是一種新興的生物技術。隨著分子生物學的發(fā)展，轉基因技術方法會不斷地得到更新。ＺＦＮ在大鼠試驗上的成功標志著轉基因技術又前進了一步。ＺＦＮ技術相對于常用轉基因方法有許多優(yōu)點，如ＺＦＮ技術已被成功應用于許多物種上、對ＤＮＡ序列的識別具有很高的特異性、在細胞水平上實現(xiàn)了基因的定向修飾、對靶基因的定點敲除、縮短試驗時間、提高試驗效率等，而這些特點則是傳統(tǒng)的轉基因技術所不能達到的。但是，由于ＺＦＮ技術是新產生的轉基因技術，其發(fā)展還不夠成熟，還有許多問題需要去研究和解決，例如如何設計、篩選具有高親和性和高特異性的鋅指蛋白，ＺＦＮ可能會對基因組非靶向性位點隨機切割，產生細胞毒性，如何更有效地調控ＺＦＮ的表達等。ＺＦＮ作為轉基因技術中新產生的有力工具，存在著巨大的潛力和價值。通過不斷地探索和實踐，相信ＺＦＮ技術會越來越成熟，并最終成為轉基因技術中的主要應用方法。

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［２３］ ＢＩＢＩＫＯＶＡ Ｍ， ＧＯＬＩＣ Ｍ，ＧＯＬＩＣ Ｋ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，１６１（３）：１１６９－１１７５．

［２４］ ＢＥＵＭＥＲ Ｋ Ｊ， ＴＲＡＵＴＭＡＮ Ｊ Ｋ， ＢＯＺＡＳ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｅｍｂｒｙｏ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５（５０）：１９８２１－１９８２６．

［２５］ ＤＯＹＯＮ Ｙ，ＭＣＣＡＭＭＯＮ Ｊ Ｍ， ＭＩＬＬＥＲ Ｊ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（６）：７０２－７０８．

［２６］ ＭＥＮＧ Ｘ，ＮＯＹＥＳ Ｍ Ｂ，ＺＨＵ Ｌ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００８，２６（６）：６９５－７０１．

［２７］ ＧＥＵＲＴＳ Ａ Ｍ，ＣＯＳＴ Ｇ Ｊ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｖｉａ ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２５（５９３９）：４３３-447．

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ） ｈａｓ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｉｎｇ ｏｕｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｎｅｗ ｃｅｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ． Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ． Ｓｏｍｅ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｍａｄｅ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｓｏｍｅ ａｎｉｍａｌｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｕｌｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｓｉｍｐｌｉｆｙ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， ｓｈｏｒｔｅｎ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｒａｔｅ． Ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ， ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｐｅｒ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）； ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ； ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ