急性缺血性腦卒中患者溶栓后血漿miR-146a、miR-21表達(dá)變化及意義

張紹夫，王飛，李航，文遠(yuǎn)超

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563003)

迄今為止，靜脈溶栓是臨床治療急性缺血性腦卒中(AIS)的有效手段[1]。然而，靜脈溶栓在一定程度上增加了患者出血性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。出血性轉(zhuǎn)化是溶栓治療后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，會(huì)導(dǎo)致患者病情急劇惡化，甚至死亡，對(duì)溶栓的治療效果及安全性造成嚴(yán)重影響，從而限制了溶栓治療的廣泛應(yīng)用[2]。研究導(dǎo)致出血性轉(zhuǎn)化的相關(guān)影響因素，對(duì)選擇溶栓適應(yīng)證，提高溶栓治療效果及安全性有重要意義。有研究認(rèn)為，微小RNAs(miRNA)與AIS患者的發(fā)病及病情進(jìn)展有一定聯(lián)系[3]。本研究探討AIS患者溶栓后血漿miR-146a、miR-21表達(dá)變化及意義，旨在為臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月～2018年2月本院收治的AIS患者89例，男48例、女41例，年齡41～82(65.42±11.50)歲；入院后根據(jù)病情予以尿激酶以及重組組織型纖溶酶活物靜脈溶栓治療；治療7 d行頭顱CT檢查，按照顱內(nèi)是否存在出血性轉(zhuǎn)化分為出血性轉(zhuǎn)化組26例、非出血性轉(zhuǎn)化組63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》[4]中AIS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭顱CT及MRI檢查確診；均接受溶栓治療；年齡>20歲；臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前接受過(guò)相關(guān)治療；入院時(shí)顱腦影像學(xué)檢查提示存在顱內(nèi)出血；美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表評(píng)分<4分；入院前3個(gè)月內(nèi)有腦梗死或心肌梗死史?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?shū)，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血糖、血脂等指標(biāo)檢測(cè) 入院后采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測(cè)血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、凝血酶時(shí)間、部分凝血酶原時(shí)間、纖維蛋白原水平。

1.3 血漿miR-146a、miR-21表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。入院后采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血漿。采用德國(guó)Qiagen公司的miRNeasy血漿提取試劑盒提取血漿總miRNA。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，內(nèi)參為U6，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括RNA模板5 μL，U6 3 μL，miRNA特異性莖環(huán)引物3 μL，100 mmol/L的脫氧核糖核苷酸0.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase抑制劑0.19 μL，無(wú)菌三蒸水4.16 μL。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，于4 ℃中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。miR-146a上游引物序列5′-CAGCTGCATTGGATTTACCA-3′、下游引物序列5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG-3′；miR-21上游引物序列5′-TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT-3′、下游引物序列5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a、miR-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 預(yù)后 溶栓治療后采用改良的Rankin量表評(píng)分(mRS評(píng)分)對(duì)患者恢復(fù)程度進(jìn)行評(píng)估[5]，完全無(wú)癥狀為0分，有癥狀但無(wú)明顯的功能障礙為1分，輕度殘疾為2分，中度殘疾為3分，重度殘疾為4分，嚴(yán)重殘疾為5分，死亡為6分。mRS評(píng)分<2分為預(yù)后良好組58例，mRS評(píng)分≥2分記為預(yù)后不良組31例。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較 出血性轉(zhuǎn)化組男16例、女10例，年齡(65.32±11.67)歲，合并高血壓17例、糖尿病9例，甘油三酯(1.25±0.49)mmol/L、總膽固醇(3.72±0.60)mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(2.05±0.62)mmol/L、高密度脂蛋白膽固醇(1.08±0.32)mmol/L，血糖(10.01±4.20)mmol/L，凝血酶原時(shí)間(15.39±2.16)s、部分凝血酶原時(shí)間(38.15±10.38)s、纖維蛋白原(3.56±0.20)g/L。非出血性轉(zhuǎn)化組男32例、女31例，年齡(65.58±11.49)歲，合并高血壓37例、糖尿病4例，甘油三酯(1.33±0.73)mmol/L、總膽固醇(4.01±1.01)mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(2.31±0.71)mmol/L、高密度脂蛋白膽固醇(1.10±0.27)mmol/L，血糖(6.58±2.19)mmol/L，凝血酶原時(shí)間(14.85±2.06)s、部分凝血酶原時(shí)間(35.39±10.52)s、纖維蛋白原(3.48±0.22)g/L。出血性轉(zhuǎn)化組糖尿病患者比例、血糖水平均高于非出血性轉(zhuǎn)化組(P均<0.05)，兩組其他指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 兩組血漿miR-146a、miR-21表達(dá)比較 出血性轉(zhuǎn)化組血漿miR-146a、miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.31、1.29±0.33，非出血性轉(zhuǎn)化組分別為1.65±0.69、0.46±0.30。出血性轉(zhuǎn)化組血漿miR-146a表達(dá)低于非出血性轉(zhuǎn)化組，miR-21表達(dá)高于非出血性轉(zhuǎn)化組(P均<0.05)。

2.3 AIS患者溶栓后發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的影響因素 多因素Logisitic回歸分析結(jié)果顯示，糖尿病、血糖水平升高、血漿miR-21高表達(dá)為AIS患者溶栓后出血性轉(zhuǎn)化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，血漿miR-146a高表達(dá)是AIS患者溶栓后出血性轉(zhuǎn)化的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AIS患者溶栓后出血性轉(zhuǎn)化的多因素Logisitic回歸分析

2.4 血漿miR-146a、miR-21表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 預(yù)后良好組血漿miR-146a、miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為1.95±0.80、0.30±0.12，預(yù)后不良組分別為1.09±0.41、0.78±0.44。預(yù)后良好組血漿miR-146a表達(dá)高于預(yù)后不良組，血漿miR-21表達(dá)低于預(yù)后不良組(P均<0.05)。

3 討論

AIS為臨床常見(jiàn)的腦卒中類(lèi)型，占腦卒中80%，已成為我國(guó)居民死亡的首位原因[6～8]。因此，對(duì)AIS患者進(jìn)行早期有效的診斷、治療顯得尤為重要。靜脈溶栓是目前全球范圍內(nèi)公認(rèn)的治療AIS最有效手段，然而該治療可能會(huì)引發(fā)出血性轉(zhuǎn)化，對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生不利影響[9，10]。隨著研究不斷深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷會(huì)導(dǎo)致缺血性腦組織中的miRNA表達(dá)發(fā)生明顯改變[11，12]。另有研究證實(shí)，miR-146a參與了免疫應(yīng)答、炎癥浸潤(rùn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡等多種生理病理過(guò)程；而miR-21參與了動(dòng)脈閉塞后常見(jiàn)的病理生理改變，包括缺血、缺氧及免疫炎癥反應(yīng)等[13，14]。

本研究結(jié)果表明，出血性轉(zhuǎn)化組糖尿病患者比例、血糖水平均高于非出血性轉(zhuǎn)化組。這與林勝利等[15]的研究相符，提示糖尿病與血糖水平可能在出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。究其原因，筆者認(rèn)為可能與高血糖會(huì)加重動(dòng)脈壁缺血、缺氧，增加動(dòng)脈壁發(fā)生變性以及壞死的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。事實(shí)上，機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)還會(huì)明顯促進(jìn)動(dòng)脈的粥樣型硬化，對(duì)患者的血管內(nèi)皮具有較大的損害，如不加以重視，發(fā)生冠脈血管內(nèi)斑塊破裂則可能引起較為嚴(yán)重的不良后果。同時(shí)出血性轉(zhuǎn)化組血漿miR-146a表達(dá)低于非出血性轉(zhuǎn)化組，而miR-21表達(dá)高于非出血性轉(zhuǎn)化組[16]?？梢?jiàn)，出血性轉(zhuǎn)化組的血漿miR-146a低表達(dá)，而miR-21高表達(dá)，二者可能均參與了出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生過(guò)程。其中miR-146a可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶分子1、活化的T細(xì)胞核因子5及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子等抑制核因子κB活性，從而發(fā)揮負(fù)相調(diào)控白細(xì)胞黏附的作用，進(jìn)一步保護(hù)血腦屏障。因此miR-146a表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞，繼而增加了出血性轉(zhuǎn)化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。而miR-21參與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)上調(diào)，而MMP-9表達(dá)增加，可通過(guò)降解毛細(xì)血管周?chē)啄さ闹饕煞?，繼而導(dǎo)致血腦屏障的通透性的增加，從而增加了出血性轉(zhuǎn)化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[17]。因此，檢測(cè)miR-146a與miR-21的表達(dá)，有助于預(yù)測(cè)AIS患者溶栓治療后出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

本研究經(jīng)多因素Logisitic回歸分析可知糖尿病、血糖水平升高、血漿miR-21高表達(dá)均為AIS患者溶栓后發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而血漿miR-146a高表達(dá)為AIS患者溶栓后發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的保護(hù)性因素。在臨床工作中可通過(guò)明確AIS患者溶栓后發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的影響因素，從而選擇更佳的治療手段，降低出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。因此，對(duì)于合并糖尿病、血糖水平明顯升高、血漿miR-146a低表達(dá)、miR-21高表達(dá)的患者，應(yīng)盡量避免予以靜脈溶栓治療。另外，本研究結(jié)果顯示，預(yù)后良好組血漿miR-146a表達(dá)水平高于預(yù)后不良組，而血漿miR-21表達(dá)水平低于預(yù)后不良組。這表明了溶栓前低表達(dá)miR-146a與高表達(dá)miR-21的患者溶栓后預(yù)后不良。在臨床工作中可通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)AIS患者血漿miR-146a、miR-21表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。黃甫高等[18～20]在研究中國(guó)人群miR-146a基因rs2910164多態(tài)性與缺血性腦卒中易感性之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-146a的表達(dá)與缺血性腦卒中具有十分緊密的關(guān)聯(lián)。雖然該研究并未涉及miR-21。但本研究發(fā)現(xiàn)miR-21也與缺血性腦卒中患者的預(yù)后聯(lián)系緊密。因此可在臨床上檢測(cè)這兩種指標(biāo)，有助于更好地評(píng)估患者的預(yù)后[21]。

綜上所述，AIS患者血漿miR-146a、miR-21表達(dá)與溶栓后出血性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，且與患者預(yù)后相關(guān)，可能成為AIS患者出血性轉(zhuǎn)化的預(yù)測(cè)指標(biāo)。這為臨床AIS患者靜脈溶栓治療以及預(yù)后評(píng)估提供了新的靶點(diǎn)和思路，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。

(收稿日期：2018-08-24)