和田維吾爾族長壽老人腸道益生乳酸菌的分離鑒定

摘 要:【目的】從和田維吾爾族長壽老人糞便中篩選并鑒定定植腸道的益生乳酸菌，通過數(shù)量和種類與一般人進行比較，為后續(xù)篩選高抑菌活性，具有降膽固醇功能的菌株提供基礎(chǔ)?！痉椒ā渴紫扔梦⑸锲桨逵嫈?shù)法統(tǒng)計糞便中的細菌總數(shù)，然后用改良的MRS+CaCO3固體培養(yǎng)基篩選乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化實驗進行初步鑒定，挑選出18株長壽老人源腸道乳酸菌和9株一般人源腸道乳酸菌，并進行16S rDNA序列鑒定?！窘Y(jié)果】從和田長壽老人糞便中分離得到乳酸菌18株，其中8株屬于植物乳桿菌，10株屬于腸球菌，一般人糞便中分離得到乳酸菌9株，都屬于腸球菌。長壽老人腸道中腸球菌占優(yōu)勢，但是一般人腸道中沒有植物乳桿菌，只有腸球菌?！窘Y(jié)論】經(jīng)形態(tài)學，生理生化，分子鑒定等方法從和田長壽老人腸道中分離出的27株乳酸菌屬于腸球菌和植物乳桿菌的不同變異品系，為進一步研究抑菌活性，降膽固醇功能，安全性并益生菌與長壽的關(guān)系奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:和田 長壽老人 乳酸菌 分離與鑒定

中圖分類號:Q文獻標識碼:A 文章編號:1674-098X(2012)03(a)-0228-03

乳酸菌是人體腸道內(nèi)重要的生理性有益菌，具有維持胃腸道正常的微生態(tài)平衡、抑制病原菌的入侵和感染以及增強機體免疫力等生理作用。

新疆和田地區(qū)是世界五大長壽區(qū)之一，我國的生物學家和醫(yī)學家曾對我國著名的長壽地區(qū)進行多次調(diào)查和研究，總結(jié)了基因和自然環(huán)境因素的影響等兩個方面是百歲老人長壽的原因。他們研究中的環(huán)境因素主要局限于群體的居住環(huán)境、食物構(gòu)成、空氣、水質(zhì)等等，而長期忽略了一個非常重要的因素—人類共生微生物。人類共生微生物是構(gòu)成人體的一個不可缺少的部分:人類自身的細胞總數(shù)大約有60兆個，而健康人自身攜帶的共生微生物的數(shù)量可以達到1000兆以上，即大于人體自身細胞數(shù)的100倍。這個數(shù)量級的生物并不是人類的身外之物，而是與人類共生共存，成為互相依存的共生體。人類的消化系統(tǒng)、皮膚表面從里到外都分布滿了各種微生物，他們決定人體的消化、免疫、代謝，人類的生存質(zhì)量，甚至左右人類的情緒。研究發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌對人體有降膽固醇、降血壓和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種保健功能。

本研究首次我國和田地區(qū)90歲以上維吾爾族長壽老人糞便為實驗材料，一般人和長壽老人的后代嬰兒糞便作為對照組，按傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察、生理生化試驗和糖發(fā)酵試驗分離出27株乳酸菌，并通過16Sr DNA序列分析方法準確地對該

菌株進行種屬歸類，為進一步研究乳酸菌的益生功能，以便探討腸道益生菌與長壽的關(guān)系奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的來源

從新疆和田墨玉縣采取的長壽老人及其對照組(一般人和長壽老人的后代嬰兒)的糞便做實驗材料。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良的MRS固體培養(yǎng)基:用于乳酸菌的分離純化。

MRS半固體培養(yǎng)基:觀察乳酸菌的運動性。

MRS液體培養(yǎng)基:用于乳酸菌的活化與理化鑒定。

明膠培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨瓊脂柱培養(yǎng)基(H2S試驗)、蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚實驗)、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基:用于生理生化鑒定。

1.1.3 藥品

藥品均為市售分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋:上海博迅公司;GXZ型智能光照培養(yǎng)箱:寧波江南儀器廠;722s分光光度計752C:上海第三分析儀器廠;奧特光學BK系列生物顯微鏡:重慶奧特光學儀器有限公司;JD200-3型電子天平:沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;SWCJ-1F型超凈工作臺:江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;哈納酸度離子計pH211:北京哈納科儀科技有限公司;

1.2 方法

1.2.1 細菌總數(shù)的測定

稱取1.0g樣品，加入到裝有9.0ml無菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-44個稀釋度。用經(jīng)滅菌并冷卻到45℃～50℃的細菌培養(yǎng)基傾倒平板，37℃培養(yǎng)48h，放在37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩天后觀察并記錄細菌數(shù)目。

1.2.2 乳酸菌的分離

稱取1.0g樣品，加入到裝有9.0ml無菌生理鹽水的試管中，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-44個稀釋度。用經(jīng)滅菌并冷卻到45～50℃的含有CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基傾倒平板，上面覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)48h，挑取淺藍色的，有溶鈣圈的菌落，轉(zhuǎn)移到MRS平板上，直到得到單菌落為止。每一個單菌落接一個裝有5mlMRS液體培養(yǎng)基的試管，上面導入一層已滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)48h。

1.2.3 乳酸菌的初步鑒定

(1)形態(tài)學鑒定:對分離得到的乳酸菌進行菌落形態(tài)觀察，進行革蘭氏染色。

(2)生理生化鑒定:對篩選的革蘭氏陽性菌菌株分別進行接觸酶實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、產(chǎn)H2S實驗、吲哚實驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗，運動性實驗，檢測在pH 4.5，溫度15℃、45℃，6.5％ NaCl下的生長情況。

1.2.4 16S rDNA序列鑒定

對被選的27株乳酸菌菌株進行16S rDNA序列鑒定，DNA提取方法參照參考文獻。

將提取所得的DNA模板進行PCR擴增，采用正向引物27f:5，-AGAGTTT GATCC

TGGCTCAG-3，反向引物1492R:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR反應(yīng)體系(25μL):引物(10μmol/L):各引物1μL;10×PCR Buffer:2.5μL;dNTP mix:2μL;Taq 酶:0.3μL;模板:1μL;超純水補足至25μL。

PCR反應(yīng)條件為:94℃4min，94℃ 30s，54℃ 30min，72℃ 2min，32個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取擴增產(chǎn)物3μL，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳液為0.5×TBE。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌總數(shù)的測定(如表1)

從表可以看出，長壽老人腸道中益生菌的數(shù)量比一般人腸道中的多。

2.2 菌株的分離、純化

通過以上的方法已分離到乳酸菌27株。

2.3 乳酸菌初步鑒定

(1)形態(tài)學鑒定:

a:菌落觀察:菌落皆為淺藍色或乳白色，圓形，形成鈣溶圈，直徑約為1-3mm。

b:革蘭氏染色:27株菌是球菌和桿菌，革蘭氏陽性菌，或叢生、或?qū)ι?/p>

(2)菌類鑒定:篩選得到27株菌皆符合乳酸菌的性質(zhì):革蘭氏陽性菌，接觸酶陰性。乳酸菌的鑒定結(jié)果如表2、表3所示:

備注:“+”表示陽性，“-”表示陰性;

Note:“+”means positive reaction，- means negative reaction

從表1，表2可以看出，已分離的27株乳酸菌均為革蘭氏染色陽性，不運動，在H2O2酶實驗、H2S實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗呈陰性，都能在15℃，45℃，pH4.5，6.5％ NaCl生長良好，不發(fā)酵蔗糖和木糖，能發(fā)酵葡萄糖和乳糖。

2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

16SrDNA基因序列在Eztaxon server 2.1中進行序列比對，得出R01-21，R01-23，R02-23，R03-12，R03-13，R03-37，R05-23，R05-34，R05-35，R05-39，R7-28，R08-22，R08-23，R08-28，R09-11，S03，S04，S08，S10為腸球菌，與其序列同源性高達99.158%以上，R01-22，R02-22，R02-24，R03-16，R03-114，R04-31，R02-25，S06為植物乳桿菌，與其序列同源性高達98.169%以上。序列提交GenBank注冊，得到序列號R01-21(HQ603855)、R01-22(HQ603856)、R01-23(HQ603857)、R02-22(HQ603858)、R02-23(HQ603859)、R02-24(HQ603860)、R02-25(HQ603861)、R03-16(HQ603862)、R03-37(HQ603863)、R03-114(HQ603864)、R03-12(JF896447)、R03-13(JF896446)、R04-31(HQ603865)、R05-23(JF896441)、R05-34(JF896444)、R05-35(JF896434)、R05-39(JF896437)、R07-28(JF896436)、R08-22(JF896435)、R08-23(JF896440)、R08-28(JF896442)、R09-11(JF896443)、S03(JF896449)、S04(JF896438)、S06(JF896439)、S08(JF896445)、S10(JF896448)、并用MEGA4.1軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，采用臨近法繪制進化樹。結(jié)果如圖1所示:

從圖1可以看出:從圖1可以看出:R02-23(HQ603859)，R01-21(HQ603855)，R09-11(JF896443)、R05-35(JF896434)，R08-23(JF896440)，R05-39(JF896437)，R05-34(JF896444)，R03-13(JF896446)，R08-22(JF896435)，R08-28(JF896442)，R03-37(HQ603863)，S03(JF896449)，S08(JF896445)，S10(JF896448)，R03-12(JF896447)，R05-23(JF896441)為Enterococcus durans的不同變異品系;R07-28(JF896436)為Enterococcus faecium的變異品系;R02-25(HQ603861)為Lactobacillus paracasei subsp.paracasei的變異品系;S06(JF896439)為Lactobacillus plantarum subsp. Argentoratensis的變異品系;R02-22(HQ603858)，R02-24(HQ603860)，R03-16(HQ603862)，R01-22(HQ603856)，R03-16(HQ603862)，R03-114(HQ603864)，R04-31(HQ603865)為Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum的變異品系。

3 結(jié)論

從和田維吾爾族長壽老人糞便中分離得到乳酸菌27株，通過形態(tài)學，生理生化和16S rDNA序列分析并參閱《伯杰士細菌學手冊》(第九版)及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》鑒定為腸球菌和植物乳桿菌。本實驗結(jié)果表明，和田長壽老人和一般人腸道中的益生菌不僅從數(shù)量上有差異，而且種類上也有差異，也就是說長壽老人腸道中腸球菌占優(yōu)勢，還有植物乳桿菌而一般人腸道中只能存在腸球菌。

腸道乳酸菌是腸道中占優(yōu)勢的益生菌之一，我國對部分菌種的抑菌性能進行了研究，但對于各種益生功能的研究，技術(shù)性能和安全性能評價，將還需要大量的工作。我國對益生菌的降血脂功能和優(yōu)良菌種的選育等方面的研究還是初步階段，因此來自人體腸道的益生菌的降膽固醇研究還未見報道，機理研究更是空白。益生菌抑菌性能的研究在國內(nèi)相對較多，但來源于人體的優(yōu)良菌株的篩選還需要大量的工作[14-16]。

為了補充這些空白本實驗的后續(xù)工作中我們從已鑒定的27株乳酸菌中篩選出抑菌活性比較強，有降膽固醇功能，安全性高的益生菌菌株并該菌株與長壽的關(guān)系進行初步研究。長壽成為全世界人們共同話題的情況下本研究的進行從開發(fā)新的益生菌產(chǎn)品，促進人類健康，延長人類歲數(shù)等方面具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻

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①基金項目:新疆特殊環(huán)境微生物實驗室開放課題基金(XJYS0203-2009-03)和中國科學院心理研究所合作項目(140696)

①作者簡介:麥熱姆妮薩·艾麥爾(1980年～)，女，研究生，研究方向:資源微生物。

烏斯?jié)M·依米提(1962～)、男、副教授、博士、研究方向-微生物資源開發(fā)