兔脛骨骨膜下注射轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1和β2促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖的研究

荊立忠 胡 躍林 郭秦?zé)?張繼英

（北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100191）

骨膜由纖維層和生發(fā)層兩部分構(gòu)成，生發(fā)層含有大量干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可分化為軟骨細(xì)胞。骨膜移植作為修復(fù)軟骨缺損的常見術(shù)式之一已有多年歷史［1，2］，其主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、可以整體移植等。但隨著年齡的增長，骨膜生發(fā)層厚度及干細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸減少［3］，是導(dǎo)致骨膜移植修復(fù)軟骨損傷效果不佳的原因之一。促進(jìn)骨膜生發(fā)層干細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其成軟骨能力，成為移植前要解決的重要問題。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等作用。在骨膜移植前通過微量注射器局部注射TGF以促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖具有微創(chuàng)、作用直接等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過比較單次注射TGFβ1或TGFβ2對(duì)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同，初步探討促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖的可行性及規(guī)律，以期提高成年動(dòng)物骨膜生發(fā)層細(xì)胞的成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

4月齡的成年新西蘭大白兔22只，（3.0±0.5）kg，雌雄不限（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證編號(hào)：SCXK京2011－0008）。

實(shí)驗(yàn)材料：Hamilton微量注射器（容量10μl，針頭30 gauge）為瑞士Hamilton公司生產(chǎn)；TGFβ1與TGFβ2為美國 Peprotech公司生產(chǎn)（catalog：100－21；100－35）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作 沿兔耳緣靜脈緩慢推注20％烏拉坦全身麻醉，術(shù)前肌注1 ml氯胺酮。以脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)為骨性標(biāo)志，在其內(nèi)側(cè)5 mm處做一5 mm的縱行皮膚切口，勿傷及深層組織，使用微量注射器于脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)內(nèi)側(cè)5 mm注射一針，于第一針以遠(yuǎn)5 mm處注射第二針（圖1）。將大白兔分為3組：①對(duì)照組，于兩位置分別注射10μl Tris溶液（Tris pH=8.0，Sigma公司）；②TGFβ1 實(shí)驗(yàn)組：于兩位置分別注射20 ng（10 μl）TGFβ1；③TGFβ2實(shí)驗(yàn)組：于兩位置分別注射20 ng（10μl）TGFβ2。

圖1 示注射部位

2個(gè)實(shí)驗(yàn)組各8只兔，對(duì)照組6只，每組兩側(cè)脛骨均納入操作。TGFβ1組：首先對(duì)全部8只兔的左側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作，于第3天對(duì)其中4只右側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作，第5天處死，從而得到3天、5天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本；于第4天對(duì)另外4只右側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作，第10天處死，從而得到7天、10天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本。對(duì)照組和TGFβ2組操作與TGFβ1組相同，只是對(duì)照組每次3只。大體觀察后取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標(biāo)本做組織學(xué)切片（每塊標(biāo)本包含2個(gè)注射點(diǎn)），這樣實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)即可獲得8個(gè)觀察數(shù)據(jù)，對(duì)照組為6個(gè)。

1.2.2 大體觀察 術(shù)后第3天、5天、7天、10天將全部兔通過注射過量烏拉坦處死，分離脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜表面深筋膜等軟組織，大體觀察各組注射位置骨膜的增生、腫脹情況。

1.2.3 標(biāo)本的處理 用骨刀切取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標(biāo)本（包含2個(gè)注射點(diǎn)），面積約10 mm×10 mm，修切整齊，立即浸入4％多聚甲醛固定24小時(shí)，生理鹽水沖洗，然后放入10％甲酸脫鈣液脫鈣5～7天，將標(biāo)本切成兩塊（每塊包含1個(gè)注射點(diǎn)），石蠟包埋后切片，厚度5μm。

1.2.4 組織化學(xué)染色及顯微鏡下觀察 將各組標(biāo)本切片脫蠟，進(jìn)行HE染色。應(yīng)用Image－Pro PLUS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行成像，低倍鏡放大200倍，測(cè)量生發(fā)層厚度（μm）、計(jì)算細(xì)胞密度（×104/cm2）；高倍鏡放大400倍，觀察細(xì)胞大體形態(tài)。為保證結(jié)果可靠，測(cè)量3次取平均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，多組之間采用單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩兩之間比較采用LSD。P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

大體觀察各組注射部位，與外周相比，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組5天、7天時(shí)間點(diǎn)的注射部位略顯腫脹，間或見注射器刺激骨膜后形成的微血管網(wǎng)。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組3天、10天及對(duì)照組僅可見微血管網(wǎng)，無明顯腫脹。各組骨膜注射部位表面均有光澤。

低倍鏡下觀察，骨膜分為兩層：淺層纖維層膠原纖維排列緊密，細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞數(shù)量少；深層（即生發(fā)層）細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多。

各組不同時(shí)點(diǎn)生發(fā)層厚度比較（表1）：對(duì)照組注射后各時(shí)點(diǎn)差異無顯著性（P＞0.05）；TGFβ1組和TGFβ2組注射后第5天生發(fā)層厚度較第3天明顯增加，最大厚度均出現(xiàn)在注射后第7天（P＜0.05），注射后第10天與第3天差異無顯著性（P＞0.05）。3組間生發(fā)層厚度比較（表 1）：注射后第3天、第10天差異無顯著性（P＞0.05）；注射后第5天、第7天TGFβ1和 TGFβ2組均明顯高于對(duì)照組，且注射后第5天TGFβ2組厚度明顯大于TGFβ1組（P=0.017）。細(xì)胞密度比較（表 1）：3組注射后不同時(shí)點(diǎn)以及3組間差異均無顯著性（P＞0.05）。

表1 注射TGFβ1和TGFβ2后不同時(shí)間段生發(fā)層厚度、細(xì)胞密度的比較

高倍鏡下觀察，對(duì)照組（圖2a）生發(fā)層細(xì)胞核呈橢圓形，藍(lán)色深染，細(xì)胞數(shù)較少。TGFβ1組注射第3天（圖2b）、第10天（圖2e）與對(duì)照組生發(fā)層細(xì)胞形態(tài)類似，第7天（圖2d）骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖顯著，胞核增大呈圓形或橢圓形，藍(lán)色深染，胞漿基質(zhì)豐富，細(xì)胞數(shù)目多。TGFβ2組第3天（圖2 f）、第10天（圖2i）生發(fā)層細(xì)胞形態(tài)與 TGFβ1組第3天（圖2b）、第10天（圖2e）類似，第5天（圖2g）與第7天（圖2h）細(xì)胞形態(tài)與 TGFβ1第7天（圖2d）類似。

圖2 注射TGFβ后不同時(shí)間點(diǎn)骨膜HE染色 A為空白對(duì)照組（×200）；B～E分別為注射TGFβ1后第3天、5天、7天、10天組（×200）；F～I(xiàn)分別為注射 TGFβ2后3天、5天、7天、10天組（×200）；右上角 a～i分別為放大400倍圖像

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及骨關(guān)節(jié)外科研究的難點(diǎn)及重點(diǎn)。利用骨髓、脂肪組織等來源的干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)室研究顯示了較滿意的結(jié)果，但由于需進(jìn)行體外培養(yǎng)、二次手術(shù)與污染風(fēng)險(xiǎn)等因素限制了其在臨床上的應(yīng)用。將骨膜應(yīng)用于各種軟骨缺損的修復(fù)已有多年歷史［1，2］。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可以整體移植，同時(shí)包含干細(xì)胞和各種細(xì)胞因子，無需體外培養(yǎng)，從而更加簡單易行。骨膜生發(fā)層干細(xì)胞在一定條件下可以分化為軟骨細(xì)胞，但隨年齡增長，其增殖分化潛能會(huì)逐漸下降［3］。因此，對(duì)于成年患者，其自身骨膜很難在細(xì)胞數(shù)量及密度上達(dá)到移植的標(biāo)準(zhǔn)［4］，這就有必要提高骨膜生發(fā)層干細(xì)胞的數(shù)量，從而提高骨膜的軟骨修復(fù)能力。近年大量實(shí)驗(yàn)研究探討了不同細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響，并且證實(shí)TGFβ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等作用［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單次注射TGFβ時(shí)細(xì)胞的增殖是短暫的、一過性的。這一結(jié)論與Reinholz等［7］的研究類似。Reinholz等觀察到向成年大白兔脛骨骨膜下單次注射TGFβ1后可以刺激骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖。其最大效應(yīng)出現(xiàn)在注射后第7天，表現(xiàn)為生發(fā)層厚度最大，細(xì)胞數(shù)目最多。不同之處在于本實(shí)驗(yàn)第3天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比雖略有增加，但并無明顯差異。此外，本研究2個(gè)實(shí)驗(yàn)組注射后10天與對(duì)照組也無明顯差別。這就進(jìn)一步提示干預(yù)后間隔時(shí)間的長短將影響到骨膜生發(fā)層的增殖，時(shí)間過長或過短均達(dá)不到理想的效果。單次注射不同于連續(xù)注射，后者往往可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生成［8，9］，但也容易導(dǎo)致骨組織的生成［8］，因此并不利于軟骨缺損的修復(fù)。本研究表明，在TGF的干預(yù)下，骨膜生發(fā)層細(xì)胞（包括干細(xì)胞）會(huì)出現(xiàn)一過性增殖。在此時(shí)間段上，如果將TGF誘導(dǎo)的骨膜移植到關(guān)節(jié)內(nèi)，保持持續(xù)性的刺激及適宜的微環(huán)境，則可能促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞進(jìn)一步向軟骨分化。

不同TGFβ亞型對(duì)不同的細(xì)胞或組織效應(yīng)各異［8］。本實(shí)驗(yàn)比較了骨膜下單次注射 TGFβ1和TGFβ2后對(duì)生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同。結(jié)果顯示單次注射兩者后生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量均會(huì)一過性增加，并且TGFβ2對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的增殖效應(yīng)更為明顯。多數(shù)研究是通過幼年動(dòng)物［8，9］或體外［10］進(jìn)行的，結(jié)果雖然也證明兩者可以促進(jìn)生發(fā)層細(xì)胞的增殖和分化，并且TGFβ2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于 TGFβ1，但成年動(dòng)物體內(nèi) TGFβ1和TGFβ2 促生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同尚無研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中TGFβ2的促增殖效應(yīng)之所以相對(duì)較好，原因可能在于 TGFβ2可以誘導(dǎo)合成TGFβ1［8］，兩者共同作用于生發(fā)層細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而導(dǎo)致更為明顯的增殖效應(yīng)。Pombo-Suarez等［11］觀察到在骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞內(nèi)，TGFβ1與TGFβ2的基因表達(dá)存在強(qiáng)烈的相關(guān)性，從而更進(jìn)一步證實(shí)了這種可能性。

本文的不足之處在于沒有對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的性質(zhì)做鑒定，畢竟生發(fā)層內(nèi)包括成骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞等較多的細(xì)胞成分。因此，注射TGFβ后增殖細(xì)胞的性質(zhì)，還有待于通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其細(xì)胞表面標(biāo)志物如 CD90、CD105 等［12，13］進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，本實(shí)驗(yàn)雖然初步確定了注射TGFβ后生發(fā)層細(xì)胞增殖的時(shí)間窗，觀察到注射后時(shí)間過短或過長增殖效應(yīng)均不明顯，但對(duì)于注射生長因子更長時(shí)間后生發(fā)層細(xì)胞的變化還有待于進(jìn)一步研究。

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