經(jīng)腦間質(zhì)微穿刺注射胞磷膽堿治療腦缺血的有效劑量范圍研究*

陳 翯 韓 鴻賓 傅 瑜 馬長城 彭 蕓 岳云龍 張學(xué)梅

（北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科 磁 共振成像設(shè)備與技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

為避開血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）對藥物的阻擋作用，使藥物和靶細(xì)胞有效接觸，減小藥物劑量，避免常規(guī)給藥途徑造成的毒副作用，學(xué)者們從20世紀(jì)末開始嘗試經(jīng)腦間質(zhì)微穿刺給藥，其中最成熟的例子就是對流增強(qiáng)給藥方式（convection enhanced delivery，CED）應(yīng)用于治療惡性膠質(zhì)瘤［1］。但自其發(fā)明至今已有16年的歷史，其發(fā)展緩慢主要是由于給藥過程缺乏有效的監(jiān)測手段，并且由于CED采用加壓給藥的方式，有潛在導(dǎo)致腦間質(zhì)水腫等并發(fā)癥的可能。最近本課題組利用小分子藥物在腦間質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散的規(guī)律，建立了微穿刺經(jīng)腦間質(zhì)簡單擴(kuò)散給藥（simple diffusion delivery，SDD）的方式。盡管已證實(shí)經(jīng)腦間質(zhì)途徑給予5μl濃度為50 mmol/L 的胞磷膽堿（cytidine 5’-diphosphocholine，CDPC）可有效保護(hù)梗死區(qū)域［2］，但藥物發(fā)揮作用的有效劑量范圍及作用機(jī)制都尚不清楚。為解決上述問題，本研究擬對50 mmol/L周圍的濃度進(jìn)行試驗(yàn)來進(jìn)一步明確經(jīng)腦間質(zhì)途徑應(yīng)用微量CDPC治療腦缺血的有效劑量范圍，為經(jīng)腦間質(zhì)途徑的微創(chuàng)給藥治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

56只普通級成年雄性SD大鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部［SYXK（京）2011－0039］，體重260～320 g。動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審批通過（LA2009－008）。

1.2 分組

56只雄性SD大鼠隨機(jī)分成7組，各8只：對照組，尾狀核中心注射生理鹽水5μl；腹腔組，腹腔注射 CDPC 2 g/kg［3］；實(shí)驗(yàn)組1～5，尾狀核中心注射CDPC 5μl，濃度分別為25、40、50、60和75mmol/L。7組均于注射后2 h行永久性大腦中動脈栓塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型。

1.3 經(jīng)腦間質(zhì)途徑給藥

實(shí)驗(yàn)組1～5：CDPC注射液（山東齊魯藥業(yè)）用生理鹽水稀釋至用藥濃度后備用。大鼠經(jīng)復(fù)合麻醉劑（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀。切開頭皮，分離骨膜，暴露前囟，使用微量注射器將5μl不同濃度的CDPC溶液以0.2 μl/min的速度均勻手推注入大鼠腦內(nèi)尾狀核區(qū)（前囟前1 mm，旁開3 mm，深4.5 mm）。注射完畢后留針5 min，再緩慢移出針頭。對照組注射方法相同，注射藥物改為生理鹽水5μl。腹腔組為腹腔注射CDPC 2 g/kg。

1.4 pMCAO 模型制作［4］

注射CDPC或生理鹽水后2 h，復(fù)合麻醉劑（3 m l/kg）腹腔麻醉后取仰臥位固定。潤滑液潤濕后備皮，做頸部前正中切口。沿氣管一側(cè)向下鈍性分離肌肉筋膜組織，保持術(shù)野清晰干凈，兩側(cè)皮膚與皮下組織用小拉鉤固定于手術(shù)臺，剪斷二腹肌，用電凝器分離下端筋膜，分離暴露右側(cè)頸總動脈。向上于頜下腺下方找到頸總動脈分叉，距分叉下1 cm處用微動脈夾夾閉頸總動脈，雙線結(jié)扎頸外動脈，距根部約0.5 cm，兩線間保證一定距離，剪斷。用電凝器夾閉頸外動脈小分支，查看頸內(nèi)動脈各分支，辨認(rèn)翼腭動脈，夾閉頸內(nèi)動脈主干。在頸外動脈上剪一小口，將線栓經(jīng)小口插入頸外動脈，松開經(jīng)內(nèi)動脈處的動脈夾，將栓子送入頸內(nèi)動脈，插入深度（距頸總動脈分叉處）約為18～22 mm，有抵抗感時(shí)停止。栓子送入后，用手術(shù)縫線固定線拴，松開頸總動脈處的動脈夾，清理手術(shù)視野后，縫合頸部皮膚。術(shù)中用電熱毯使大鼠保持恒定體溫，術(shù)野覆蓋濕紗布。

1.5 梗死灶體積定量［5］

pMCAO術(shù)后12 h斷頭取腦。在－20℃條件下對新鮮鼠腦進(jìn)行速凍以增加硬度，將鼠腦置于腦切片模具中，沿視交叉向后切片，每片厚約2 mm。將腦片置于0.2％的2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyl－tetrazolium chloride，TTC）染色液中，在37℃溫箱中染色15～30 min（染色期間不斷翻動使染色均勻）。染色后的腦片經(jīng)4％多聚甲醛固定并攝片。用Image－Pro－Plus 6.0軟件測量梗死灶的體積百分比，計(jì)算公式如下：

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

見圖1，梗死灶體積百分比在pMCAO大鼠模型不同處理組間差異顯著（F=11.164，P=0.000）。實(shí)驗(yàn)組2、3和4三組大鼠的平均梗死體積百分比明顯小于對照組（P均=0.000）。雖然實(shí)驗(yàn)組1、5和腹腔組大鼠的平均梗死體積百分比與對照組相比有下降趨勢，差異無顯著性（P分別為0.419，0.965，0.423）。故認(rèn)為經(jīng)腦間質(zhì)途徑應(yīng)用CDPC治療腦梗死的有效濃度范圍是40～60 mmol/L。

3 討論

本研究證實(shí)，經(jīng)腦間質(zhì)途徑應(yīng)用SDD微穿刺給予微劑量CDPC可成功避開BBB的阻擋，有效預(yù)防缺血性腦損傷，其有效濃度范圍是40～60 mmol/L，僅為常規(guī)腹腔給藥劑量的1/800，而神經(jīng)保護(hù)效率卻極大提升，達(dá)到了微創(chuàng)治療的目的。盡管目前無法在腦缺血發(fā)生前對人體實(shí)施經(jīng)腦間質(zhì)途徑的預(yù)防性給藥，但是對于冠狀動脈旁路移植術(shù)后卒中的預(yù)防［6］，或許這是一個(gè)潛在有效的替代措施。

腦間質(zhì)自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)以來，被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞與血液之間最重要的物質(zhì)交換通道之一。正常腦組織中間質(zhì)的平均容積分?jǐn)?shù)超過20％［7］，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腦微血管占全腦容積的比例（＜3％），為藥物在腦內(nèi)的擴(kuò)散與分布提供了解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。經(jīng)腦間質(zhì)給藥治療最早由Bobo等于1994年提出，其核心理念為CED，即通過施加一個(gè)正向液壓梯度向腦內(nèi)持續(xù)注射藥物，該方法被認(rèn)為是未來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效途徑［8］。CED的優(yōu)勢在于大分子藥物在腦間質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散受限，應(yīng)用持續(xù)加壓給藥可以使藥物到達(dá)靶區(qū)。由于CED采用持續(xù)加壓給藥，因此容易引起腦水腫等并發(fā)癥，有效性及穩(wěn)定性仍待提高［9］。然而，對于小分子物質(zhì)，如 CDPC，可以不借助任何外加壓力，只依賴局部濃度梯度所致的自由擴(kuò)散運(yùn)動就可到達(dá)靶區(qū)，這就使得非外加壓力性的微創(chuàng)、微劑量給藥（SDD）成為可能，并可有效避免CED因持續(xù)加壓注射引起的腦水腫等并發(fā)癥。

圖1 pMCAO大鼠模型不同處理組梗死灶的TTC染色結(jié)果（白色為梗死區(qū)，梗死體積百分比：對照組，27.7％±10.5％；腹腔組，24.0％±10.4％；實(shí)驗(yàn)組1，27.5％±11.9％；實(shí)驗(yàn)組 2，8.1％±4.1％；實(shí)驗(yàn)組3，4.1％±2.0％；實(shí)驗(yàn)組4，8.7％±2.4％；實(shí)驗(yàn)組5，24.0％±12.9％）

決定CDPC神經(jīng)保護(hù)效率的關(guān)鍵因素是到達(dá)靶組織的藥物局部濃度。根據(jù)擴(kuò)散方程，腦ECS中的藥物濃度不僅依賴于擴(kuò)散，還依賴于清除。既往關(guān)于腦脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）腦內(nèi)引流的研究表明，實(shí)驗(yàn)所用放射性示蹤劑可在尾狀核內(nèi)長時(shí)間貯留，2 h后僅有10％～15％的示蹤劑進(jìn)入CSF團(tuán)流［10］，這一結(jié)論為本研究結(jié)果提供了佐證。而CDPC對側(cè)腦室旁組織和丘腦區(qū)的“乏保護(hù)”，則是清除速率過快的結(jié)果，推測與該區(qū)域BBB結(jié)構(gòu)不完整有關(guān)［11］。此外，藥物清除還受到腦間質(zhì)容積分?jǐn)?shù)和迂曲度的影響，由腦缺血引起的細(xì)胞水腫，將會縮小腦間質(zhì)的容積分?jǐn)?shù)［12］，增加迂曲度，從而降低藥物的清除速率，這可能也是CDPC藥效得以充分發(fā)揮的重要原因。

總之，本研究確定了經(jīng)腦間質(zhì)微穿刺注射CDPC治療腦缺血的有效藥物劑量范圍，為經(jīng)腦間質(zhì)途徑的微創(chuàng)給藥治療提供了有價(jià)值的參考依據(jù)。

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