雌激素及其受體與IL-17在HPV16持續(xù)感染階段的表達(dá)研究

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(1.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201299；2.上海市浦東醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201309；3.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200011)

目前已經(jīng)證實(shí)人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是子宮頸癌發(fā)生的必要因素，幾乎100%的子宮頸癌病變中都能檢測到HPV，HPV16是HPV中的高危型，與50%以上宮頸癌有關(guān)[1]。HPV感染很常見，通常通過性行為傳播。在世界范圍內(nèi)，大多數(shù)女性在一生中都會感染HPV。對于性行為活躍的婦女，宮頸感染HPV很普遍。據(jù)調(diào)查，有20%～25%的青春期少女或大學(xué)階段的女性HPV-DNA檢測陽性[2]。然而，目前尚未研制出HPV的針對性治療藥物，大部分感染HPV的女性機(jī)體免疫系統(tǒng)可將其清除，所以感染不會持續(xù)或發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。低危型HPV自發(fā)清除時間為4～9個月，高危型HPV(high risk human papiIlomavirus，HR-HPV)為8～12個月，僅有約10%的感染會持續(xù)，這部分感染者才是發(fā)生宮頸癌的高危人群。如果對所有感染HR-HPV的患者進(jìn)行治療，勢必造成大量不必要的醫(yī)療資源浪費(fèi)。研究表明雌激素及其受體與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-7]；IL-17是Th17細(xì)胞產(chǎn)生的一種免疫因子，可以上調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答，清除病毒或細(xì)菌等。本課題探討在宮頸細(xì)胞學(xué)正常僅為HPV感染階段，雌激素(estradiol，E2)、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)及白介素-17(interleukin-17，IL-17)所發(fā)揮的作用，試圖從HPV感染患者中找出持續(xù)性感染患者，為縮小目標(biāo)人群提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

樣本人群為2014年5月到2017年5月于上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院門診或住院患者或健康體檢人員中進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(HPV分型檢測方法)發(fā)現(xiàn)的HR-HPV型陽性或陰性、宮頸病理學(xué)正常者，凡符合納入標(biāo)準(zhǔn)，且志愿參加者，簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～50歲、漢族、在上海居住2年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：已妊娠或1年內(nèi)有妊娠計劃者、口服避孕藥患者、帶激素類避孕器者、患免疫系統(tǒng)疾病(包括HIV患者)、卵巢切除患者、卵巢現(xiàn)患病者、閉經(jīng)、絕經(jīng)及月經(jīng)不規(guī)律患者。

本研究納入對象102例，其中4例在研究過程中病理學(xué)轉(zhuǎn)為CIN Ⅱ級及以上，5例在研究過程中妊娠，3例返鄉(xiāng)，隨訪失敗，以上12例均剔除研究。本研究共納入90例，按照HPV感染的不同，將研究對象分為3組：HPV陰性組，連續(xù)1年檢測HPV均為陰性；單一HPV16陽性，但在后續(xù)的檢測中，HPV16逐漸被清除，簡稱HPV16清除組；單一HPV16陽性，但在后續(xù)的檢測中，持續(xù)存在，簡稱HPV16持續(xù)感染組。其中HPV陰性組30例，年齡(38.43±11.35)歲；HPV16感染清除組30例，年齡(39.26±10.39)歲；HPV16感染持續(xù)組30例，年齡(36.61±10.95)歲。3組研究對象在年齡、居住地、婚姻狀況等人口學(xué)特征方面分布基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

對研究對象均選擇在卵泡期(月經(jīng)周期第5～8天)行宮頸脫落細(xì)胞TCT檢查及陰道鏡活檢組織病理檢查，陰道鏡下見可疑病變者取病變處組織，陰道鏡下未見明顯病變者取宮頸3、6、9、12點(diǎn)處組織，組織送病理檢查，病理切片用免疫組化法檢測雌激素受體的表達(dá)；采用上海達(dá)安醫(yī)學(xué)檢測中心的HPV檢測專用宮頸刷采集宮頸脫落細(xì)胞行HPV分型及定量檢測；研究對象于卵泡期(月經(jīng)周期第5～8天)抽空腹靜脈血檢測雌二醇水平。

宮頸灌洗液：參照文獻(xiàn)[8]，在入選對象抽血當(dāng)天同時取宮頸灌洗液。暴露宮頸口，用5 mL滅菌生理鹽水沖洗宮頸口及宮頸表面，于后穹隆吸出灌洗液4 mL，混勻后分裝入1.5 mL無菌EP管中，3 000 r/min，4 ℃離心5 min。取上清分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于檢測宮頸微環(huán)境中免疫細(xì)胞因子IL-17表達(dá)水平。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定雌激素水平及宮頸灌洗液中IL-17水平

應(yīng)用美國Biocheck公司生產(chǎn)的ELISA檢測試劑，嚴(yán)格按照操作規(guī)程，批量測定血清中雌二醇(E2)及宮頸灌洗液中IL-17的含量。每塊測定板均設(shè)雙份標(biāo)準(zhǔn)系列和質(zhì)控，利用伯樂-450酶標(biāo)儀，于450 nm單波長下讀取各孔吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本中E2及IL-17的含量。

1.4 用免疫組化SP法檢測ER

單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP檢測用TBS代替一抗作為陰性對照，乳腺癌組織作為陽性對照。實(shí)驗步驟嚴(yán)格按照試劑說明書操作。ER以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞，1%～20%為弱陽性(+)，21%～30%為中等強(qiáng)度陽性(++)，大于30%為強(qiáng)陽性(+++)。陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/計數(shù)細(xì)胞總數(shù)。陽性面積指數(shù)=陽性區(qū)域面積×OD/總面積

1.5 隨訪復(fù)診與指標(biāo)檢測

所有研究對象每3個月重復(fù)上述所有檢測一次，連續(xù)1年。如在研究過程中，患者宮頸病理學(xué)轉(zhuǎn)為異常，則剔除該實(shí)驗組，根據(jù)相關(guān)診療規(guī)范進(jìn)行治療，研究過程中避孕失敗而妊娠的對象也予以剔除。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件經(jīng)計算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料ER的陽性面積指數(shù)統(tǒng)計應(yīng)用χ2檢驗，計量資料E2及IL-17的含量采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2水平波動值

1年內(nèi)各組研究對象體內(nèi)雌激素E2水平波動值：HPV陰性組為(3.026 0±0.0153 6)pg/mL，HPV16清除組為(3.005 0±0.0197 9)pg/mL，HPV16持續(xù)感染組為(3.045 0±0.0187 5)pg/mL，3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.226，P=0.309)。

2.2 ER的表達(dá)

各組ER表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.406,P=0.067)，見表1、圖1。

表1 ER在各組中的表達(dá)(n=30)

a:HPV16持續(xù)感染組；b:HPV16清除組；c:HPV陰性組

2.3 IL-17的表達(dá)

HPV陰性組IL-17改變量(2.13±0.11) pg/mL，HPV16清除組(24.32±0.31) pg/mL，HPV16持續(xù)感染組(2.08±0.15) pg/mL，IL-17表達(dá)濃度差在HPV陰性組與HPV16持續(xù)感染組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(t=1.47，P=0.1463)，二者與HPV16清除組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HPV16清除組中IL-17濃度明顯增高。

3 討論

前瞻性隊列研究顯示在性行為開始后很快就會發(fā)生高危型HPV的感染，大約有一半的年輕女性在開始性行為后的3年內(nèi)就會感染HPV[9]。

因?qū)m頸癌發(fā)病率和病死率逐年升高，而HR-HPV持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件，所以絕大部分感染了HR-HPV的患者迫切希望得到有效治療清除HR-HPV，進(jìn)而減少或杜絕宮頸癌的發(fā)生。但感染了HR-HPV患者僅有約10%感染會持續(xù)，這部分感染者才是發(fā)生宮頸癌的高危人群。如果對所有感染HR-HPV的患者進(jìn)行治療，勢必造成大量不必要的醫(yī)療資源浪費(fèi)。因此，如果能有某種方法在宮頸病理學(xué)正常的患者中提前篩選出HR-HPV持續(xù)性感染者，針對性治療隨訪，必將節(jié)省大量醫(yī)療資源。目前對影響HPV清除和持續(xù)感染的因素及宮頸局部微環(huán)境在此過程中的作用尚不清楚。

HPV傳播和潛伏感染發(fā)生在女性下生殖道局部。并不會引起全身癥狀或病毒血癥，因此，宮頸局部免疫狀態(tài)在HPV感染結(jié)局中發(fā)揮關(guān)鍵作用。宮頸移行帶是HPV感染的主要部位。雌激素是一組類固醇類化合物，在婦女的生育周期中極其重要。在女性體內(nèi)主要有3種雌激素:雌二醇、雌三醇、雌酮。從月經(jīng)初潮到絕經(jīng)期最主要的雌激素是17β-雌二醇[10]。子宮是雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的靶器官，宮頸鱗狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞的交界區(qū)，既是雌激素作用的最敏感部位，也是最易受到HPV感染的區(qū)域[11]。研究表明，雌激素能促進(jìn)宮頸靶細(xì)胞增殖，并可作為助催化劑促進(jìn)、啟動致癌過程[3]。

高水平的雌激素可增加宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險，但是作為激素發(fā)生生理效應(yīng)的重要中介物質(zhì)，激素受體是激素與腫瘤發(fā)生聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。激素受體能反映內(nèi)源性激素的水平及其變化情況。目前可識別的雌激素受體有ERα和ERβ，商品化的ER抗體指的是ERα。在正常情況下，ERα主要存在于子宮、輸卵管、宮頸；ERβ主要分布于卵巢，在子宮、宮頸、陰道表達(dá)較弱，在生育期，很少表達(dá)于輸卵管。近年研究發(fā)現(xiàn)隨著CIN病變程度的增加，ERα的表達(dá)逐漸減弱，二者存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，表明ERα的表達(dá)減弱與宮頸病變進(jìn)展有一定的關(guān)系[11]。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)宮頸細(xì)胞學(xué)正常的HR-HPV感染階段，無論是HPV16清除組還是持續(xù)感染組，2組中的E2水平的變化與HPV陰性組無明顯差異，同時ER在該2組中的表達(dá)與HPV陰性組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。我們推測在HR-HPV持續(xù)感染階段，患者體內(nèi)的內(nèi)源性E2并未發(fā)生明顯改變，說明在HR-HPV的感染初始階段，E2對感染的影響不大，因此我們不能通過E2水平的變化從HR-HPV感染患者中找出持續(xù)性感染者。本研究中ER在HPV16清除組、HPV16持續(xù)感染組及HPV陰性組中表達(dá)水平無明顯差異，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果似乎不一致[4，11]，但我們的研究對象是宮頸細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)正常的患者，而上述學(xué)者[4，11]的研究對象則是宮頸癌和癌前病變患者，組織病理學(xué)不同，所以結(jié)果不同。通過研究，我們認(rèn)為ER的表達(dá)量主要與組織病理學(xué)的改變有關(guān)，3組研究對象均是組織病理學(xué)正常的患者，因此ER的表達(dá)水平在3組間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，故我們也不能通過ER水平的檢測預(yù)檢出HR-HPV持續(xù)感染患者。

近年來研究的熱點(diǎn)“腫瘤微環(huán)境”認(rèn)為炎癥、免疫、腫瘤三者有著密切的關(guān)系，認(rèn)為炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移中都扮演了重要角色[12]。Th17細(xì)胞被認(rèn)為是一群重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，該類細(xì)胞能激活樹突狀細(xì)胞和T淋巴輔助細(xì)胞，通過釋放細(xì)胞因子來維持慢性炎癥狀態(tài)和導(dǎo)致癌變的微環(huán)境。Th17分泌的細(xì)胞因子除了IL-17(IL-17A)外，還包括IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6等細(xì)胞因子[13]。IL-17是一種重要的炎癥介質(zhì)，其可以通過誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子(如IL-6)及趨化因子(如MCP-1、MIP-2)等的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞到局部的浸潤及組織損傷[14]。大量的實(shí)驗結(jié)果顯示，IL-17在各種感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、移植物抗宿主等疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用[15-19]。

本課題通過對宮頸局部微環(huán)境中IL-17的檢測發(fā)現(xiàn)，IL-17表達(dá)濃度差在HPV陰性組與HPV16持續(xù)感染組間無明顯差異，二者與HPV16清除組之間IL-17濃度差異顯著，在感染清除組中IL-17濃度明顯較初始感染時增高，這說明IL-17濃度的增加有利于HPV病毒的清除。但文獻(xiàn)報道IL-17具有促進(jìn)多種腫瘤生長的作用，這些腫瘤包括膀胱癌、皮膚癌、卵巢癌、乳腺癌[20-21]。IL-17和肝癌有著密切的關(guān)系，肝癌細(xì)胞中IL-17經(jīng)過活化IL-6/JAK2/STAT3的AKT通路，促進(jìn)肝癌的發(fā)生與進(jìn)展[22-23]。樊金炎等[24]研究發(fā)現(xiàn)在CIN及宮頸癌患者血清中IL-17表達(dá)水平高于慢性宮頸炎患者。這些似乎與我們的實(shí)驗結(jié)果有所不同，但我們的課題研究對象是宮頸細(xì)胞學(xué)正常的人群，與癌癥患者不同，我們推測IL-17在HPV病毒感染階段的作用機(jī)制可能與其在癌癥中的作用機(jī)制不同。

通過初步研究，我們認(rèn)為在HR-HPV感染陽性的患者中，IL-17的增加有利于HPV病毒的清除，反之IL-17變化不明顯的患者可能預(yù)示著將進(jìn)展為持續(xù)性感染。但本課題因研究對象及研究時間所限，且宮頸局部微環(huán)境復(fù)雜，陰道內(nèi)微生態(tài)亦復(fù)雜，究竟一種還是多種免疫因子對HPV病毒的清除產(chǎn)生了影響，尚需要進(jìn)一步深入的研究。

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