正交試驗(yàn)優(yōu)選薄荷總黃酮超聲提取工藝研究

喻林華，方 晰，田春燕，蘇恒楓

正交試驗(yàn)優(yōu)選薄荷總黃酮超聲提取工藝研究

喻林華，方 晰，田春燕，蘇恒楓

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410004）

優(yōu)選薄荷總黃酮的最佳提取工藝。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以薄荷為原料，采用分光光度法測定總黃酮含量，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲提取時(shí)間（C）和水浴溫度（D）為考察因素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。結(jié)果影響薄荷總黃酮提取效果的主次因素為：B＞C＞D＞A，優(yōu)選出薄荷總黃酮最佳提取工藝為B2C2D1A1，即液料比為30∶1，超聲波提取時(shí)間40 min，水浴溫度50℃，提取液乙醇的濃度為40%。在該工藝條件下，薄荷總黃酮得率為9.89%。采用超聲波提取工藝方法簡單、安全、快速。

薄荷；正交試驗(yàn)；總黃酮；超聲提取

薄荷Mentha haplocalyx Brip.又稱蘇薄荷、水薄荷、魚香草、人丹草等，是常見的中藥材料，重要的天然香料。薄荷作為中藥, 味辛散，性涼。有疏散風(fēng)熱、清利咽喉、透疹的功能；用于感冒風(fēng)熱、頭痛、目赤、咽喉紅腫疾痛、皮膚瘙癢、疹透發(fā)不暢[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，薄荷含揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸、氨基酸等化學(xué)成分，對中樞、消化、呼吸等系統(tǒng)的藥理作用明顯，薄荷提取物中含有黃酮類、酚類等強(qiáng)有力的自由基清除劑，具有抗氧化作用[2]，故薄荷被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。超聲波提取技術(shù)在提取薄荷中黃酮類物質(zhì)的研究中報(bào)道不多，為此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波乙醇提取法提取薄荷中的總黃酮，并優(yōu)選薄荷總黃酮最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

新鮮薄荷葉（采集于中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)）；NaNO2，NaOH，無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（98%，長沙市邁科為生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器設(shè)備

FZ102型微型植物粉粹機(jī)、恒溫水浴鍋、恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-5200D 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；722S可見光分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[3]

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒溫，用電子天平準(zhǔn)確稱取0.005 0 g，用濃度30%的乙醇溶解于25 mL的容量瓶中，制成濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，再依次加入2 mL濃度30%乙醇溶液、0.3 mL濃度5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入2 mL濃度4%NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇溶液定容至刻度線，靜置15 min，以30%乙醇溶液為空白，于波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)。

1.3.2 薄荷總黃酮的提取方法

將新鮮薄荷葉洗凈晾干后，置于溫度為60℃的恒溫干燥箱中干燥15小時(shí)，中間不定時(shí)地翻動(dòng)葉子，使其干燥至恒重。用微型植物粉粹機(jī)盡快將干燥好的薄荷葉粉碎成粉末，密封，置于陰涼干燥處備用。

準(zhǔn)確稱取薄荷葉粉末1.000 0 g于250 mL的錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，封口，并在一定溫度水浴一段時(shí)間，然后超聲提取一定時(shí)間，冷卻后，過濾，定容至250 mL，搖勻，取2 mL置于10 mL容量瓶中，按步驟1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制相同的方法，測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算樣品中總黃酮的含量：

總黃酮含量（mg）=（C×10）/2×250

總黃酮得率=（總黃酮含量/干薄荷葉粉末質(zhì)量）×100%

(C：標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的總黃酮濃度（mg/mL）；10：測試液定容體積（mL）；250：待測液總體積（mL）；2：測試液體積（mL）。)

乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、水浴溫度為薄荷葉總黃酮提取率的主要影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響提取效果的主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)方法

1.3.3.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1.000 0 g的薄荷葉粉，加入30 mL濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在60℃溫度下水浴1 h，超聲提取30 min，冷卻過濾，將濾液定容至250 mL，在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)，研究不同乙醇濃度對薄荷葉總黃酮提取率的影響。

1.3.3.2 液料比對總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1.000 0 g的薄荷葉粉，分別加入30%乙醇溶液10 mL、 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，此時(shí)液料比（體積質(zhì)量比mL/g）為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶ 1、50∶ 1，在60℃溫度下水浴1 h，超聲提取30 min，冷卻過濾，將濾液定容至250 mL，在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)，研究不同液料比對薄荷葉總黃酮提取率的影響。

1.3.3.3 超聲波提取時(shí)間對總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1.000 0 g的薄荷葉粉，分別加入30 mL濃度為30%的乙醇溶液，在60℃溫度下水浴1 h，分別超聲提取20、30、40、50、60 min后，冷卻過濾，將濾液定容至250 mL，在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)，研究不同超聲波提取時(shí)間對薄荷葉總黃酮提取率的影響。

1.3.3.4 水浴溫度對總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1.000 0 g的薄荷葉粉，加入30 mL濃度為30%的乙醇溶液，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的溫度下水浴1 h，超聲提取30 min，冷卻過濾，將濾液定容至250 mL，在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)，研究不同水浴溫度對薄荷葉總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)方法

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，薄荷葉以乙醇濃度A、液料比B、超聲提取時(shí)間C、水浴溫度D為4個(gè)考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)（見表1），以總黃酮得率為考察指標(biāo)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果，確定從薄荷葉中提取總黃酮的最佳工藝。

表1 正交因素水平表L9（34）Table 1 The factor levels of design in orthogonal test method

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1），得回歸方程：A=8.842 9C-0.001 9，R2=0.999 2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of Rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

從圖2中可知，用濃度40%～50%的乙醇提取總黃酮得率有所增大，而在乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮得率有所降低。

圖2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

這可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素等成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同水分子的結(jié)合, 從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取量下降，故選擇乙醇濃度為40%～60%做進(jìn)一步研究。

2.2.2 液料比對總黃酮得率的影響

從圖3可知，在液料比10∶1和20∶1之間，總黃酮得率增加幅度最大，而液料比30∶1、40∶1、50∶1之間，總黃酮得率減小幅度不大，而且總黃酮得率均比液料比10∶1的得率高得多。

圖3 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of the liquid-material rate on total flavonoids yield

這可能是乙醇溶液太少以致未能完全浸沒葉粉，使得在超聲提取中，葉粉未能與乙醇接觸完全，細(xì)胞難以完全破碎，故選擇液料比20∶1、30∶1、40∶1做進(jìn)一步研究。

2.2.3 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響

從圖4可知，隨著超聲提取時(shí)間的延長，總黃酮得率逐漸提高，但超聲波處理40 min后得率降低。

圖4 超聲時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of the extraction time on total flavonoids yield

這可能是因?yàn)殚L時(shí)間超聲處理對黃酮的結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生了破壞作用，故選擇超聲提取時(shí)間30 ～50 min做進(jìn)一步研究。

2.2.4 水浴溫度對總黃酮得率的影響

從圖5中可知，隨著溫度的升高，總黃酮得率也有所增加，但水浴溫度達(dá)到60℃后，總黃酮得率有所降低。

圖5 水浴溫度對總黃酮得率的影響Fig.5 The effect of the extraction temperature on total flavonoids yield

這有可能是因?yàn)闇囟冗^高對黃酮造成一定程度的破壞，故選擇水浴溫度為50℃～70℃做進(jìn)一步研究。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

優(yōu)選出薄荷總黃酮最佳提取工藝：提取液乙醇的濃度為40%，液料比為30:1，超聲波提取時(shí)間40min，水浴溫度50℃。超聲波提取薄荷葉總黃酮時(shí)各因素影響大小順序?yàn)椋築＞C＞D＞A，即液料比＞提取時(shí)間＞水浴溫度＞乙醇濃度（如表2）。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

超聲波提取技術(shù)（Ultrasonic Wave Extraction）是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行[4]。余煉等人[5]以乙醇為溶劑，采用超聲波提取蠶沙中的類黃酮，得率為2.358%（即23.58 mg/g），相較于李巖亮[6]采用乙醇提取蠶沙中的黃酮得率0.643%（即6.43 mg/g），提高了近4倍。傳統(tǒng)的提取分離方法 (如煎煮法等)存在活性成分提取率不高、 雜質(zhì)清除率低等問題，這些根本問題制約了中藥開發(fā)的進(jìn)程。近些年來，一些新技術(shù)如超聲波提取法、超臨界流體萃取等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的提取，但超臨界流體萃取技術(shù)儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴、操作繁瑣，超聲波提取法儀器設(shè)備相對廉價(jià)。我們的實(shí)驗(yàn)表明，利用超聲波提取薄荷葉總黃酮的辦法可行，而且方法簡單，快速，操作安全，為薄荷葉總黃酮得提取方法提供了很好的理論依據(jù)。

該實(shí)驗(yàn)表明，利用超聲波提取薄荷葉總黃酮的方法簡單，快速，操作安全。

3 結(jié) 論

采用分光光度法測定總黃酮含量，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲提取時(shí)間（C）和水浴溫度（D）為考察因素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。結(jié)果影響薄荷總黃酮提取效果的主次因素為：B＞C＞D＞A，優(yōu)選出薄荷總黃酮最佳提取工藝為B2C2D1A1，即液料比為30∶1，超聲波提取時(shí)間40 min，水浴溫度50℃，提取液乙醇的濃度為40%。在該工藝條件下，薄荷總黃酮得率為9.89%。說明采用超聲波提取工藝方法簡單、安全、快速。

[1] 肖培根.新編中藥志: 第三卷[M] .北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

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[6] 李巖亮. 蠶沙中黃酮類化合物提取及純化的研究[J].遼寧絲綢,2006,(2):10-12.

Opimization of ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from Mentha haplocalyx by orthogonal test

YU Lin-hua, FANG Xi, TIAN Chun-yan, SU Heng-feng
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

To study the optimum extraction process of total flavonoids from mentha haplocalyx, with Rutin as a standard and the Mentha haplocalyx as the subject, the percent of total flavonoids was tested by spectrophotometer. During the extracting process, concentration of ethanol（A）, liquid-material rate（B）,extraction time（C）, extraction temperature（D）were studied by using single-factor experiment. Based on the single factor analysis method, the best conditions of extracting total flavones were optimized by orthogonal.The factors which influenced the extraction rate were sorted as followings: B＞C＞D＞A.The optimum extraction process of total flavones from mentha haplocalyx was B2C2D1A1, liquid-material rate 30∶1, ultrasonic extraction time 40 minutes, extraction temperature 50℃, ethanol concentration 40%.Under the conditions, the total flavonoids yield was 9.89%.The ultrasonic extraction method is simple,safe and fast.

Mentha haplocalyx; orthogonal test; total flavonoids; ultrasonic extraction

S567.23+5

A

1673-923X(2012)08-0094-04

2012-05-15

喻林華（1977—），女，湖南寧鄉(xiāng)人，講師，碩士，主要從事生物技術(shù)方面的研究

方 晰（1968—），女，廣西邕寧人，教授，博士，主要從事生態(tài)學(xué)方面的研究；E-mail：Fangxizhang@sina.com

[本文編校：吳 彬]