模擬昆蟲取食對紅皮云杉幼苗根部酶活性的影響
——根部中保護(hù)性酶和防御酶活性的變化情況

馬曉乾，滑 莎，宋小雙，趙紅盈，遇文婧，范海娟

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院 森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

模擬昆蟲取食對紅皮云杉幼苗根部酶活性的影響
——根部中保護(hù)性酶和防御酶活性的變化情況

馬曉乾1，滑 莎1，宋小雙1，趙紅盈1，遇文婧1，范海娟2

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院 森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

通過不同損傷處理模擬地下害蟲取食紅皮云杉幼苗根部，分析測定不同程度損傷后紅皮云杉幼苗根部中保護(hù)性酶和防御酶活力的變化情況。結(jié)果表明：不同損傷處理模擬地下害蟲取食后，均不同程度誘導(dǎo)了幼苗根部保護(hù)酶和防御酶活力的升高，表明模擬昆蟲取食后誘導(dǎo)紅皮云杉幼苗增加了抗蟲性；其中25%損傷誘導(dǎo)紅皮云杉幼苗根部過氧化氫酶(CAT) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活力均較對照升高明顯，而50%和75%損傷程度誘導(dǎo)與對照相比較有所升高，但不明顯；其中25%損傷后5 d CAT活力，25%損傷后12h和3d、50%損傷后6 h和10 d SOD活力，25%損傷后3、6、12h和1d、50%損傷后3、6、12h和3d PAL活力和25%損傷后12、1d和10 d、50%損傷后12h、75%損傷后3d PPO活力均與對照差異顯著。

模擬昆蟲取食；紅皮云杉；酶活性；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；苯丙氨酸解氨酶；多酚氧化酶

植物在自然界長期進(jìn)化的過程中形成了多種自我防御機(jī)制，這種自我防御機(jī)制是植物與生境長期相互作用逐步發(fā)展而成的，可分為組織防御和誘導(dǎo)防御。植物受到損傷、昆蟲取食等影響后，不僅營養(yǎng)物質(zhì)會發(fā)生變化，而且還會誘導(dǎo)植物體內(nèi)保護(hù)性酶和防御酶等的變化。保護(hù)性酶包括過氧化氫酶(CAT) 、過氧化物酶(POD) 和超氧化物歧化酶(SOD) ，這些都是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶[1]，能有效地抑制活性氧（ROS ）對植物細(xì)胞膜、DNA 和蛋白質(zhì)的侵害[2-3]，維持體內(nèi)氧化代謝的平衡，從而保證植物的健康生長。許多研究表明：CAT、POD 和 SOD的活性與抗蟲性有關(guān)[4-7]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的活力是反應(yīng)植物抗性指標(biāo)的生化指標(biāo)[8],有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲取食和病原菌攻擊后防御酶活力水平升高[9-10]。對寄主植物受到損傷或昆蟲取食后誘導(dǎo)寄主植物體內(nèi)保護(hù)性酶和防御酶活性變化的研究，有助于揭示寄主植物誘導(dǎo)抗蟲的原理及植食性昆蟲與寄主植物之間的相互作用機(jī)制關(guān)系。紅皮云杉Picea koraiensis為東北及華北地區(qū)主要森林及城市綠化樹種，目前有關(guān)損傷模擬昆蟲取食后紅皮云杉幼苗體內(nèi)保護(hù)性酶和防御酶活性的變化等相關(guān)研究還未見報(bào)道。本研究通過不同損傷處理模擬地下害蟲取食紅皮云杉幼苗根部，探討不同處理后對紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活力的誘導(dǎo)隨時間變化情況及不同處理誘導(dǎo)變化的差異性，為紅皮云杉遺傳改良和抗蟲育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本采集

于2011年6月下旬至8月上旬期間，在黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)國家級實(shí)驗(yàn)苗圃基地（東經(jīng) 128°37′44″～ 129°17′51″； 北 緯 46°50′10″～47°21′33″），選擇2年生紅皮云杉幼苗，進(jìn)行根部損傷（25%、50%、75%）處理，以無損傷云杉幼苗為對照（CK）。處理后分3、6、12h及1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 d采集標(biāo)本，置入便攜式冰箱帶回室內(nèi)，而后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2 主要儀器及藥劑

主要儀器：T6-751紫外分光光度計(jì)、TG16-WS臺式高速離心機(jī)均為北京六一儀器廠制造。主要試劑：pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯比咯烷酮）、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、EDTA-Na2、核黃素、pH值為8.8的硼酸鹽緩沖溶液、苯丙氨酸、羥基乙醇硼酸緩沖液等均由哈爾濱市化學(xué)試劑公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

將采集的2年生云杉幼苗除根部外全剪去，然后將根部剪成1cm左右小段，稱取0.100～0.400 g，移入研缽，加液氮研磨呈勻漿，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，待液氮蒸發(fā)后置-20 ℃冰箱內(nèi)保存，一周內(nèi)測定。

1.2.2 測定方法

過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活力測定分別采用紫外吸收法、氮藍(lán)四唑法、紫外吸收法和分光光度法[11]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。對不同損傷程度模擬昆蟲取食后，紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活力隨時間的變化用Duncan’s法分析其差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶活力的影響

通過不同程度損傷模擬地下害蟲取食后，紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶活力有所升高，因損傷程度不同表現(xiàn)出一定的差異，在不同時間也呈現(xiàn)一定的差異（見圖1）。3h后，不同損傷程度紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫活力與對照無明顯差異；6 h后，不同程度損傷后過氧化氫酶活力均有所升高，而后表現(xiàn)出一定的差異性。25%損傷后過氧化氫酶活力不斷升高至1d時呈下降趨勢，與對照接近，3d時又呈上升趨勢至5 d時達(dá)到最高值，后呈下降趨勢，10 d后略高于對照并逐漸向?qū)φ湛拷?0%損傷后過氧過氧化氫酶活力呈現(xiàn)升高至1d時開始表現(xiàn)為下降趨勢，至2d時與對照接近后呈現(xiàn)與對照無明顯差異。75%損傷后過氧化氫酶活力6 h后表現(xiàn)為下降，1d時與對照接近，而后繼續(xù)下降至2d時為最低，后逐漸升高接近對照，5 d后與對照無明顯差異。對不同程度損傷后不同時間紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶活力所測的數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s法進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示，25%損傷后5 d時過氧化氫酶活力與對照相比較差異顯著。

圖1 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中過氧化氫酶活力的影響Fig.1Effects of different damage degree on CAT activity in roots of Picea koraiensis seedling

2.2 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中超氧化物歧化酶活力的影響

通過不同程度損傷紅皮云杉幼苗根部模擬地下害蟲取食后，誘導(dǎo)了紅皮云杉幼苗根部中超氧化物歧化酶的變化，不同損傷程度呈現(xiàn)一定的差異性(見圖2)。3h后不同損傷程度后紅皮云杉幼苗根部中超氧化物歧化酶活力均有所升高。25%損傷后超氧化物歧化酶活力表現(xiàn)為升高并呈一定的波動性，12h達(dá)到最高值，1d時與對照接近，后又呈上升趨勢，在3d時達(dá)到高峰，而后逐漸波動趨向?qū)φ眨?5 d后接近對照并與對照波動一致。50%損傷后6 h后下降， 12h后與對照超氧化物歧化酶活力變化無明顯差異。75%損傷后超氧化物歧化酶活力在1d至3d間低于對照，而后呈波動變化，與對照無明顯差異。對不同程度損傷后不同時間紅皮云杉幼苗根部中超氧化物歧化酶活力所測的數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s法進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示，25%損傷后12h和3d時，50%損傷后6 h和10 d時超氧化物歧化酶活力與對照相比較差異顯著。

圖2 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中超氧化物歧化酶活力的影響Fig.2Effects of different damage degree on SOD activity in roots of Picea koraiensis seedling

2.3 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中苯丙氨酸解氨酶活力的影響

通過不同程度損傷紅皮云杉幼苗根部模擬地下害蟲取食后，誘導(dǎo)了紅皮云杉幼苗根部中苯丙氨酸解氨酶活力的變化，不同損傷程度誘導(dǎo)酶活力變化有一定的差異性（見圖3）。不同損傷程度3～6 h之間苯丙氨酸解氨酶活力均表現(xiàn)為升高，其中25%和75%損傷酶活力升高比較明顯，而后呈現(xiàn)不同波動趨勢。25%損傷6 h后苯丙氨酸解氨酶酶活力呈平穩(wěn)逐漸下降趨勢至10 d時基本與對照接近，而后與對照無明顯差異。50%損傷6 h后苯丙氨酸解氨酶活力表現(xiàn)為下降趨勢至1d時與對照接近，而后又表現(xiàn)為升高趨勢至3d時為最高值，接著表現(xiàn)為下降趨勢至10 d后與對照接近，而后與對照無明顯差異并呈現(xiàn)一致的波動性。75%損傷苯丙氨酸解氨酶活力6 h后也表現(xiàn)為下降趨勢至1d后與對照基本一致。對不同程度損傷后不同時間紅皮云杉幼苗根部中苯丙氨酸解氨酶活力所測的數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s法進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示，25%損傷后3、6 、12h和1d，50%損傷后3h、6 h、12h和3d時苯丙氨酸解氨酶活力與對照相比較差異顯著。

圖3 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中苯丙氨酸解氨酶活力的影響Fig.3Effects of different damage degree on PAL activity in roots of Picea koraiensis seedling

2.4 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中多酚氧化酶活力的影響

通過不同損傷程度模擬地下害蟲取食紅皮云杉幼苗根部后，誘導(dǎo)了紅皮云杉幼苗根部中多酚氧化酶活力的變化，不同損傷程度酶活力變化表現(xiàn)為一定的差異性（見圖4）。3h后，不同程度損傷后多酚氧化酶活力均無明顯變化，而后表現(xiàn)出一定的差異性。25%損傷后6 h多酚氧化酶活力表現(xiàn)為升高趨勢至12h后為最高，后呈緩慢下降趨勢至3d時與對照接近，于10 d時又呈現(xiàn)升高趨勢，而后表現(xiàn)出逐漸下降，于30 d時基本與對照一致。50%損傷后多酚氧化酶活力在6 h、2d、和15 d時表現(xiàn)為略高于對照，12h表現(xiàn)為略低于對照，其他時間點(diǎn)與對照無明顯差異。75%損傷后多酚氧化酶活力在6 h、3d時略低于對照，其余時間點(diǎn)與對照均無明顯差異。對不同程度損傷后不同時間紅皮云杉幼苗根部中多酚氧化酶活力所測的數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s法進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示，25%損傷后12h、1d和10 d時，50%損傷后12h時，75%損傷后3d時多酚氧化酶活力與對照相比較差異顯著。

圖4 不同損傷程度對紅皮云杉幼苗根部中多酚氧化酶活力的影響Fig.4 Effects of different damage degree on PPO activity in roots of Picea koraiensis seedling

3 結(jié)論與討論

植物在長期適應(yīng)生境的過程中，形成了多種自我防御體系，在受到植食性昆蟲等生物侵害時，能夠誘導(dǎo)植物自身防御機(jī)制的啟動即誘導(dǎo)抗蟲性[12]。系統(tǒng)獲得的抗性，是植物抵抗植食性昆蟲侵害的機(jī)制之一[13]。研究發(fā)現(xiàn)，植物在受到植食性昆蟲侵害時，其體內(nèi)保護(hù)酶和防御酶系會發(fā)生適應(yīng)性的變化，如過氧化氫酶(CAT) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）是植物誘導(dǎo)抗性機(jī)制中發(fā)揮保護(hù)作用的物質(zhì)[14-15]。植物誘導(dǎo)抗性是保護(hù)性酶和防御性酶催化和調(diào)節(jié)下實(shí)現(xiàn)的[16]。超氧化物歧化酶是活性氧的清除劑，具有維持植物體內(nèi)活性氧平衡的功能。過氧化氫酶能夠清除超氧化物岐化酶催化產(chǎn)生的H2O2，抑制其在細(xì)胞內(nèi)的增加。苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶在植物體內(nèi)莽草酸代謝途徑中能介導(dǎo)合成木質(zhì)素、酚類物質(zhì)等，因此產(chǎn)生抗蟲性[17]。在該項(xiàng)研究中，通過不同損傷處理模擬地下害蟲取食紅皮云杉幼苗根部后，均不同程度誘導(dǎo)了幼苗根部保護(hù)酶和防御酶活力的升高，表明模擬昆蟲取食后誘導(dǎo)紅皮云杉幼苗增加了抗蟲性。其中25%損傷誘導(dǎo)紅皮云杉幼苗根部過氧化氫酶

(CAT) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活力均較對照升高明顯，而50%和75%損傷程度誘導(dǎo)與對照相比較有所升高，但不明顯。表明隨著損傷程度的加重，保護(hù)性酶和防御性酶活力增加并不顯著，且有接近或低于對照的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象是由于紅皮云杉幼苗根部不同損傷模擬昆蟲取食后，不同程度的抑制或阻止、催化或加速了寄主植物體內(nèi)發(fā)生的多途徑的代謝過程的綜合表現(xiàn)。

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Effects of simulating insect feeding on enzyme activity in roots of Picea koraiensis seedling: changes of protective and defense enzyme activity

MA Xiao-qian1, HUA Sha1, SONG Xiao-shuang1, ZHAO Hong-ying1, YU Wen-jing1, FAN Hai-juan2
(1. Forest Protection, Heilongjiang Academy of Forestry Institute, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

Through simulating soil pests feeding Picea koraiensis seedlings roots with different injury, the protective and defense enzyme activity changes in the roots of Picea koraiensis seedlings in varying degrees of damage were determined and analyzed. The results show that after different injury treatments of simulated soil pests feeding, at the seedling roots, the protective enzymes and defense enzyme activity were induced and increased by different levels, this showed that the simulated insect feeding induced by Picea koraiensis seedlings had increased the insect resistance; of the 25% injured toots’ CAT SOD, PAL and PPO activities increased signif i cantly comparing with the control, the 50% and75% injured toots’ induction and activity increased slightly but not obvious; after 5 days 25% damage CAT activity, 25% damage after 12hours and 3days, 6 hours and 10 days after the 50% damage SOD activity, 25%damage 3hours, 6 hours, 12hours and 1day, 50% damage after 3hours, 6 hours,12hours, 12hours and 3days the PAL vitality, and 25%after injury, 1day and 10 days 50% 12hours after damage, 75% after damage, their PPO activities had signif i cant differences compared with the control.

simulated insect feeding; Picea koraiensis; enzyme activity; CAT; SOD; PAL; PPO

S763

A

1673-923X(2012)09-0037-04

2012-05-12

黑龍江省森工總局應(yīng)用研究項(xiàng)目(sgzjY2010017)

馬曉乾（1979-），男，寧夏人，助理研究員，碩士，從事森林病蟲害方面的研究工作；E-mail：369086324@qq.com

[本文編校：謝榮秀]