三種色譜法分析鮑魚生殖腺多糖的單糖組成

宋葉涵李冬梅，2楊靜峰，2朱蓓薇，2

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術(shù)研究分中心（大連），遼寧 大連 116034）

三種色譜法分析鮑魚生殖腺多糖的單糖組成

宋葉涵1李冬梅1，2楊靜峰1，2朱蓓薇1，2

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術(shù)研究分中心（大連），遼寧 大連 116034）

為了選擇一種準(zhǔn)確有效的方法測(cè)定鮑魚生殖腺多糖（AGP－32）的單糖組成。采用薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法對(duì)AGP－32的單糖組成進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：高效液相色譜法較其它色譜方法具有分離效果好，并可同時(shí)檢測(cè)中性糖、糖醛酸和氨基糖等特點(diǎn)，并利用該法得到單糖組成的摩爾比為 Man∶Rha∶GlcA∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Fuc＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。說明高效液相色譜法較其它色譜法更加適合于鮑魚生殖腺多糖這類復(fù)雜樣品的單糖組成分析。

鮑魚；生殖腺多糖；硫酸酯多糖；單糖組成；薄層色譜法；氣相色譜法；高效液相色譜法

鮑魚屬軟體動(dòng)物門、腹足綱，是名貴的海珍品，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值［1］。鮑魚生殖腺多糖是從鮑魚生殖腺中分離得到的硫酸酯多糖。近年來的研究［2－7］表明，鮑魚生殖腺多糖具有一定的抗氧化、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤及抗凝血等活性。鮑魚生殖腺多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣，療效明顯，因此有必要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究。單糖組成分析作為研究多糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，因而成為一項(xiàng)亟待解決的問題。

本試驗(yàn)通過薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法3種衍生化方法，對(duì)鮑魚生殖腺多糖的單糖組成進(jìn)行定性和定量分析，并對(duì)不同的衍生化方法的特點(diǎn)和測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，為今后準(zhǔn)確和有效地選用這些方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮑魚生殖腺：大連獐子島漁業(yè)有限公司；

D－甘露糖、D－半乳糖、D－葡萄糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、L－阿拉伯糖、D－葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D－氨基葡萄糖鹽酸鹽共10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

三氟乙酸、三氯甲烷和甲醇：均為色譜純；

1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、吡啶、鹽酸羥胺、乙酸酐、六甲基二硅胺烷、硼氫化鈉、醋酸、碳酸鈉、正丙胺、三甲基氯硅烷：均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

氣相色譜儀：6890N，美國Agilent公司；

石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm）：HP－5，美國Agilent公司；

高效液相色譜儀：LC－10Avp，日本島津公司；

Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）：Tigerkin系列液相色譜柱，大連思普精工有限公司；

氮?dú)獯蹈蓛x：DN－12A，天津市樂康科技有限公司。

1.3 鮑魚生殖腺多糖的分離純化

依據(jù)本課題組［1］前期建立的蛋白酶水解提取法提取鮑魚生殖腺粗多糖（abalone gonad polysaccharide，AGP）。將提取的鮑魚生殖腺多糖以Sevag法去除蛋白，采用Cellulose DEAE－52柱和Sepharose CL－6B柱，收集得到純度良好的鮑魚生殖腺多糖（AGP－32）。

1.4 薄層色譜法

準(zhǔn)確稱取20mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的硫酸中，在100℃下，水解6h，用BaCO3中和至中性，4 000r/min離心10min、取上清液。分別稱取10mg的葡萄糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖及混合標(biāo)準(zhǔn)單糖，并分別加入2mL蒸餾水溶解。點(diǎn)樣量為2μL，在貯有展開劑正丁醇∶水∶乙醇（3∶2∶5）的展開箱中，上行展開，展距10cm。從展箱中取出薄板，吹干，放入顯色劑乙醇∶濃硫酸 （9∶1）水溶液中，取出吹干，100℃加熱顯色約8min［8］。

1.5 氣相色譜法

1.5.1 糖腈乙酸酯衍生化法

（1）多糖的水解：準(zhǔn)確稱取10mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的三氟乙酸中，充N2密封，在100℃下水解4h，反復(fù)加甲醇并用N2吹干，作為AGP－32水解產(chǎn)物備用。

（2）單 糖的衍生化［9］：向 AGP－32水解產(chǎn)物中，加入8mg鹽酸羥胺、0.5mL吡啶、1mg肌醇，漩渦振蕩后，于90℃水浴中加熱30min，取出后冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，在90℃恒溫水浴乙?；?0min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.45μm濾膜過濾后注入氣相色譜進(jìn)行分析；標(biāo)準(zhǔn)單糖作同法處理，并制成標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合液。

（3）色譜條件：HP－5石英毛細(xì)管色譜柱；載氣為N2；采用氫火焰離子檢測(cè)器（FID），進(jìn)樣口氣化溫度250℃，檢測(cè)溫度250℃，柱溫采用程序升溫：從0min到5.00min為130℃，然后以4.00℃/min的速度由130℃升至240℃保留10.00min。

1.5.2 三甲基硅醚衍生化法

（1）多糖的水解［1］：準(zhǔn)確稱取10mg AGP－32，加入2mL無水HCl－甲醇，充N2封管，80℃甲醇解20h。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，以無水KOH－甲醇中和至pH 6.0，減壓蒸干，常規(guī)干燥，作為AGP－32甲醇解產(chǎn)物備用。

（2）單糖的衍生化［1］：向 AGP－32甲醇解產(chǎn)物中加入0.2mL無水吡啶（內(nèi)含飽和甘露醇，作內(nèi)標(biāo)），振蕩搖勻，于恒溫干燥箱75℃溶解30min，再振蕩均勻，加入0.3mL硅烷化試劑六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷（2∶1），振蕩，靜置30min，3 000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行氣相色譜分析；標(biāo)準(zhǔn)單糖作同法處理，并制成標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合液。

（3）色譜條件：HP－5石英毛細(xì)管色譜柱；載氣為N2；氫火焰離子檢測(cè)器（FID），進(jìn)樣口氣化溫度250℃，檢測(cè)溫度250℃，柱溫采用程序升溫：從0min到1min為150℃，然后以10℃/min的速度升至182℃，保持2min，再以1℃/min的速度升至188℃，保持1min，最后以8℃/min的速度升至230℃。

1.6 PMP柱前衍生化高效液相色譜法

1.6.1 多糖的水解 參照文獻(xiàn)［10］。稱取2mg AGP－32溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸，充N2密封，于121℃水解2h，取出后加無水甲醇，N2吹干，作為AGP－32水解物備用。

1.6.2 衍生化標(biāo)記 參照文獻(xiàn)［10］。分別稱取甘露糖、葡萄糖、D－氨基葡萄糖及半乳糖各0.001 8g，鼠李糖及巖藻糖各0.001 6g，木糖及阿拉伯糖各0.001 5g，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各0.001 9g，混合，作為混合標(biāo)準(zhǔn)單糖備用。將AGP－32水解物、10種標(biāo)準(zhǔn)單糖（各10mg）和混合標(biāo)準(zhǔn)單糖，溶于5mL氨水中，取該溶液100μL與100μL的PMP/甲醇溶液（0.5mol/L）混合，在70℃下反應(yīng)30min。取出后冷卻至室溫，加入1.5mL純水，真空干燥，重復(fù)2次。干燥后的物質(zhì)用1mL純水及1mL氯仿溶解，充分振蕩后除去有機(jī)相，重復(fù)3次，靜置30min，取上清液進(jìn)行HPLC分析。

1.6.3 色譜條件 色譜柱 Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流 動(dòng) 相 0.1mol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液（Na2HPO4－NaH2PO4，pH 6.7）－乙腈（83∶17），流速1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫30℃；標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣體積10μL，樣品進(jìn)樣體積20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜法測(cè)定結(jié)果

采用TLC法測(cè)定AGP－32單糖組成的結(jié)果見圖1。根據(jù)各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值和所顯顏色，可以初步確定AGP－32主要由鼠李糖和半乳糖組成，但由于個(gè)別單糖的顯色斑點(diǎn)有重疊，因此難以分辨AGP－32中可能含有的其它單糖。

圖1 AGP－32多糖水解物薄層色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of AGP－32hydrolysates

2.2 氣相色譜法測(cè)定結(jié)果

2.2.1 糖腈乙酸酯衍生化法測(cè)定結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖見圖2。由圖2可知，該法得到的單糖出峰時(shí)間短，峰形對(duì)稱，未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，并且得到較好的基線分離效果。AGP－32多糖水解成單糖后的糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖見圖3。根據(jù)圖2和圖3的出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)照，再經(jīng)歸一化法求得各單糖組成的摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 ＝1.34∶0.54∶0.26∶1.10∶0.11∶5.91。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Figure 2 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of monosaccharide standards

圖3 AGP－32水解后糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Figure 3 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives after acidic hydrolysis

2.2.2 三甲基硅醚衍生化法測(cè)定結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)單糖的三甲基硅醚衍生物氣相色譜圖見圖4。三甲基硅醚化衍生物具有揮發(fā)性好，制備簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn)［11］，但由圖4可知，該法產(chǎn)生了較多的異構(gòu)峰，給多糖的定性和定量帶來了一定的困難。AGP－32多糖水解成單糖后的三甲基硅醚衍生化物氣相色譜圖見圖5。對(duì)照?qǐng)D4和圖5的單糖出峰時(shí)間，經(jīng)歸一化法計(jì)算得各單糖的組成摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖 ＝0.71∶1.73∶0.3∶17.97。此結(jié)果與2.2.1比較可知，三甲基硅醚衍生化法未能得到完整的單糖組成信息。

2.2.3 高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)單糖的PMP衍生物的高效液相色譜圖見圖6，采用柱前衍生化高效液相色譜法進(jìn)行分析時(shí)，各單糖間具有理想的分離度，并且PMP峰未掩蓋單糖峰。AGP－32多糖水解成單糖后的PMP衍生物的高效液相色譜圖見圖7。

根據(jù)各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，可確定AGP－32是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖組成的雜多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積之比，采用歸一化法求得AGP－32中單糖組成的摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶巖藻糖＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。從峰面積百分比可以看出，鼠李糖和半乳糖在該多糖中所占比例較大，是鮑魚生殖腺多糖的主要成分，這與氣相色譜法分析單糖組成得到的結(jié)果基本一致。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖三甲基硅醚衍生物的氣相色譜圖Figure 4 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide standards

圖5 組分AGP－32三甲基硅醚衍生物的氣相色譜圖Figure 5 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide of AGP－32

圖6 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的PMP衍生物的色譜分離圖Figure 6 Chromatograms of PMP derivatives of monosaccharide standard samples

圖7 AGP－32水解后的PMP衍生物的色譜分離圖Figure 7 Chromatograms of PMP derivative of hydrolysate of fraction AGP－32

3 討論

采用薄層層析法與各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值和所顯顏色進(jìn)行比較，可以初步確定AGP－32主要含有鼠李糖和半乳糖，但由于部分單糖的顯色斑點(diǎn)有重疊，因此難以分辨是否含有其他單糖。采用TLC測(cè)定單糖組成具有操作簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，但分辨率不高，一般只作定性或半定量分析。

氣相色譜分析主要是利用試樣中各組分在色譜柱氣相和液相間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行的。同種單糖經(jīng)不同的衍生化處理后得到不同的衍生產(chǎn)物，出現(xiàn)極性差異，保留時(shí)間發(fā)生較大變化［12］。

三甲基硅醚衍生化法具有制備簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，衍生物揮發(fā)性好等特點(diǎn)，但是該法易產(chǎn)生多種衍生物的異構(gòu)體，給定性和定量帶來一定的困難。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用三甲基硅醚衍生化法并未得到完整的AGP－32單糖組成信息，其中未檢測(cè)到葡萄糖，而半乳糖含量相對(duì)較高。這很可能是由于D－葡萄糖和D－半乳糖是異構(gòu)體，而這二種構(gòu)型相近的己糖可能形成相同的二肟，因此這二個(gè)糖的二肟三甲基硅醚衍生物得到一個(gè)峰［13］。

糖腈乙酸酯衍生化法反應(yīng)時(shí)間短，各峰分離效果好，異構(gòu)峰相對(duì)較少，單糖組成定性及定量準(zhǔn)確，其中單糖組分中含量較高的是鼠李糖、半乳糖和甘露糖，這與薄層色譜法和三甲基硅醚衍生化法測(cè)定結(jié)果一致。但此法僅適合于醛糖的分析，酮糖因缺乏還原端而難以衍生，糖醛酸與氨基糖也不適用于此法［14］。對(duì)酮糖的分析可選用三甲基硅醚衍生化方法。

高效液相色譜法通過導(dǎo)入具有紫外或熒光的化學(xué)基團(tuán)對(duì)糖類進(jìn)行柱前衍生，其優(yōu)點(diǎn)是可以在溫和的條件下與還原糖鏈進(jìn)行定量反應(yīng)，生成在紫外245nm處有強(qiáng)烈吸收的衍生物，而且產(chǎn)物無立體異構(gòu)現(xiàn)象［14］。本試驗(yàn)采用PMPHPLC法測(cè)定AGP－32多糖的單糖組成，不僅可以檢測(cè)出鼠李糖、甘露糖和半乳糖等中性糖，而且還可同時(shí)檢測(cè)葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，并可進(jìn)行定量分析。該法得到的單糖組成結(jié)構(gòu)信息完整，定性準(zhǔn)確，其中鼠李糖與半乳糖比例相對(duì)較高，此現(xiàn)象與以上幾種方法所得結(jié)論相符，因此高效液相色譜法較薄層色譜法和氣相色譜法更適合于單糖組成較為復(fù)雜的樣品分析。

4 結(jié)論

薄層色譜法操作快捷有效、無需衍生化處理，但單糖間的分離效果較差，比較適合對(duì)單糖組成較為簡(jiǎn)單的樣品進(jìn)行定性分析。氣相色譜法和高效液相色譜法檢測(cè)靈敏度高、分離效果好、定量準(zhǔn)確，但氣相色譜法不適合糖醛酸和氨基糖的分析。高效液相色譜法可同時(shí)檢測(cè)AGP－32中中性糖、糖醛酸和氨基糖，較其它單糖組成測(cè)定方法更加適合于像鮑魚生殖腺多糖這種復(fù)雜樣品的單糖組成分析。

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Comparison of three chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of abalone gonad polysaccharide

SONG Ye－h(huán)an1LI Dong－Mei1，2YANG Jing－feng1，2ZHU Bei－wei1，2

（1.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China；2.National R＆D Branch Center for Shellfish Processing（Dalian），Dalian，Liaoning116034，China）

To find an accurate and effective method to determine the monosaccharide composition of polysaccharide from abalone gonad（AGP－32）.Thin layer chromatography，gas chromatography and high performance liquid chromatography were used to determine the monosaccharide composition of AGP－32.Results：Method of high performance liquid chromatography had good resolution，and it was suitable to simultaneous analyses of neutral，acidic and alkaline monosaccharide.The monosaccharide composition of AGP－32which identified by this method was Man∶Rha：GlcA∶GalA∶Glc∶Gal：Xyl∶Fuc＝ 0.79：2.05∶1.6：0.58∶0.09：4.91∶0.11∶0.34.Conclusion：High performance liquid chromatography is more suitable than other chromatographic methods to complicated monosaccharide composition analysis of polysaccharide such as abalone gonad polysaccharide.

abalone；gonad polysaccharide；sulfated polysaccharide；monosaccharide composition；thin layer chromatography；gas chromatography；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.011

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31171635）

宋葉涵（1987－），女，大連工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：songyehan＿2007＠126.com

楊靜峰

2012－01－01