黃連等中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑制作用

于靜 戴東曉 謝景朝 李軍如 陳惠珍

·論著·

黃連等中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑制作用

于靜 戴東曉 謝景朝 李軍如 陳惠珍

目的比較黃連等6種中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑菌效果。方法采用M－H瓊脂稀釋法檢測6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的體外抑菌作用，測定最小抑菌濃度(MIC)、MIC50、MIC90及累積抑菌百分率。結(jié)果濃度為1∶320(3.125 mg/ml)時(shí)，六種中藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，黃連抑菌率明顯高于其他組(χ2=56.74P=0.000)。濃度為1∶40(25 mg/ml)時(shí)，6種中藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，五味子、大黃、黃連、連翹抑菌率高于烏梅、黃芩(χ2=8.381，P=0.004)，烏梅、黃芩二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.471，P=0.062)。濃度為1∶20(50 mg/ml)時(shí)，6種中藥有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，烏梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。濃度為1∶10(100 mg/ml)時(shí)，6種中藥差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，抑菌率均為100%。結(jié)論6種中藥中黃連抑菌效果最好，烏梅、黃芩作用較弱。

根管消毒;糞腸球菌;中藥;水煎劑;MIC

糞腸球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)在治療前的根管中并不是優(yōu)勢菌，但在根管消毒和充填后，其比例卻大大提高，成為最常見的細(xì)菌種類。它在根管治療后的根管中為優(yōu)勢菌，占發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的24%～77%［1］?？谇粌?nèi)科治療中使用的傳統(tǒng)治療方法，難以將定植于根管中的糞腸球菌徹底清除［2］，從而導(dǎo)致根管治療后疾病的發(fā)生。近年來，如何抑制或殺滅根管內(nèi)的糞腸球菌，提高根管治療術(shù)的成功率逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，尋找新型根管消毒藥物是滿足口腔內(nèi)科牙體治療需要的必然趨勢。本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，選用五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩6種中藥對32株糞腸球菌進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，以期對六種中藥抗糞腸球菌性能作出初步評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑:五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩，以上品種的中藥飲片，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院提供，均購自河北省藥材公司。0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，批號:091019107)。Mneller-Hinton瓊脂(簡稱M-H瓊脂，美國BD公司生產(chǎn))。糞腸球菌32株(石家莊市第二醫(yī)院細(xì)菌室提供)，所有菌株分離鑒定均參照李仲興編寫的《診斷細(xì)菌學(xué)》［3］進(jìn)行，必要時(shí)采用微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定。

1.1.2 設(shè)備:Model LS-B75L-Ⅱ全自動立式蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)。多點(diǎn)接種儀(北京醫(yī)科大學(xué)昆侖藥物發(fā)展研究所生產(chǎn))。電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東省濰坊醫(yī)療器械廠)。微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)(上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司)。一次性使用細(xì)菌培養(yǎng)皿(直徑為90 mm，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥水煎劑溶液的制備:稱取中藥飲片五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩各50 g，每味藥分別置砂鍋中，加10倍量水浸泡過夜，后加熱至沸，改用文火煎煮30 min，趁熱濾過，濾渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，濾過，合并兩次濾液于燒杯中，水浴濃縮后放涼至室溫，50 ml容量瓶定容，倒入廣口瓶中，高壓滅菌(0.1～0.11 MPa，121℃，15 min)，取出放涼備用，得每毫升相當(dāng)于原藥材1 g(1∶1)的中藥水煎劑溶液。

1.2.2 藥液稀釋及含藥血平板制備:取無菌試管11只，除第1、10號管外，于其余管中各加0.9%氯化鈉溶液10 ml，于1號管、2號管分別加人1 g/ml中藥水煎劑10 ml，2號管混勻后取出10 ml加入3號管，3號管混勻后取出10 ml放入4號管，如此連續(xù)稀釋至9號管，從9號管取出的10 ml放入10號管，第10號管作無菌陰性對照管，第11號管只有0.9%氯化鈉溶液，作無藥陽性對照管。這樣1～9號管均含有10 ml倍比稀釋的藥液，濃度分別為1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91 mg/ml(即1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256)。

將已配好的無菌M-H瓊脂(pH值為7.4)熔化，在無菌操作下吸取M-H瓊脂16 ml置于三角瓶中，再從1號管中取出4 ml藥液置于同一瓶中，搖勻，倒入平板，凝固后備用，得1號含藥平板，含藥量為200 mg/ml(1∶5)。2～11號平板的制備同1號，這樣1～10號含藥血平板的藥物含量分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.782，0.782 mg/ml(即1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶140，1∶1280，1∶1280)，第10號含藥平板作無菌陰性對照，第11號平板作無藥陽性對照。

1.2.3 菌液制備及接種:將糞腸球菌新鮮培養(yǎng)物(菌落)用0.9%氯化鈉溶液稀釋制成菌懸液，濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，?jīng)稀釋后的受試菌在15 min內(nèi)以多點(diǎn)接種儀接種，最終接種量為每點(diǎn)104 cfu，菌液接種于含藥平板上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。每種藥物的第10號平板不接種細(xì)菌，作無菌陰性對照;第11號平板不含藥物接種細(xì)菌，作無藥陽性對照。

1.2.4 最小抑菌濃度測定:觀察含藥平板的菌落生長情況，如果對照菌全部生長，則觀察最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，以無細(xì)菌生長平板內(nèi)藥物的最小濃度為此藥對該菌株的最小抑菌濃度即MIC。根據(jù)含藥平板的菌落生長數(shù)及未生長數(shù)，統(tǒng)計(jì)藥物抑制50%，90%細(xì)菌時(shí)的最小濃度，即MIC50，MIC90和累積抑菌百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的MIC、MIC50、MIC90及累積抑菌百分率結(jié)果見表1、2。第10號平板(無菌陰性對照)無糞腸球菌生長。第11號平板(無藥陽性對照)糞腸球菌正常生長。

表1 6種藥水煎劑對32株糞腸球菌的MIC、MIC50、MZC90

表2 6種藥水煎劑對32株糞腸球菌的累積抑菌百分率%

表3 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶320)

表4 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶20)

表5 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶40)

表6 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶10)

2.2 6種中藥水煎劑對糞腸球菌有不同程度抑制作用，同一種中藥對糞腸球菌的不同菌株表現(xiàn)出相近的抑菌活性。黃連抑菌效果最好，其MIC90為1∶320(3.125 mg/ml)。濃度為1∶320 (3.125 mg/ml)時(shí)，6種中藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。再經(jīng)兩兩比較后得出黃連抑菌率明顯高于其他組(χ2=56.74，P=0.000)。效果較好的有五味子、大黃、連翹，MIC90分別為1∶40(25 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml);濃度為1∶40(25 mg/ml)時(shí)，6種中藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。再經(jīng)兩兩比較后得出五味子、大黃、黃連、連翹抑菌率高于烏梅、黃芩(χ2=8.381，P=0.004)。烏梅、黃芩作用較弱，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.471，P=0.062)。且濃度為1∶20 (50 mg/ml)時(shí)，6種中藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。烏梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。在固體培養(yǎng)基中，中草藥水煎劑抑制糞腸球菌的效果隨藥液濃度的增加而增加。當(dāng)濃度達(dá)到1∶10(100 mg/ml)時(shí)，各藥物平板中均無菌落生長(P＞0.05)。6種中藥抑菌率相同，均為100%。見表3～6。

3 討論

多數(shù)中藥及其復(fù)方制劑具有廣譜抗菌、調(diào)節(jié)免疫、恢復(fù)人體微生態(tài)平衡、增強(qiáng)抗感染免疫、干預(yù)抗藥性形成和轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)抗藥性的特點(diǎn)，這些優(yōu)勢讓中藥在臨床應(yīng)用中極具潛力。且中藥水煎劑制備相對簡便，不良反應(yīng)小，不易產(chǎn)生耐藥性，因此進(jìn)一步將其用于臨床是十分經(jīng)濟(jì)和安全有效的。有學(xué)者通過對腸球菌的體外抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)五味子、黃連、烏梅和黃芩對腸球菌有較好的抑菌效果［4，5］;連翹為廣譜抗菌藥;大黃對腸球菌也有一定的抑菌效果［6］。與其他中藥相比，黃連有其獨(dú)特之處。因糞腸球菌屬腸球菌屬，以上研究為本實(shí)驗(yàn)選用此六種中藥作為抑制糞腸球菌的實(shí)驗(yàn)藥物提供了參考依據(jù)。也有學(xué)者將其中的一些藥物應(yīng)用于口腔及根管消毒，取得了較好的效果。但針對于抑制糞腸球菌的中藥研究卻很少見。本實(shí)驗(yàn)通過選取已被臨床證實(shí)對多種病原菌有較好抑菌效果且具有代表性的6種中藥(五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩)進(jìn)行體外抗菌效果觀察，發(fā)現(xiàn)其對糞腸球菌有體外抑制作用，其試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這為臨床根管消毒藥物的選擇提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并且為口腔醫(yī)學(xué)中藥物的篩選提供了一種新的具有可行性和實(shí)用意義的研究方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連水煎劑對糞腸球菌的抗菌作用優(yōu)于其他參試中藥，考慮與黃連的主要抑菌成分黃連素(小檗堿)有關(guān)。黃連素具有廣譜抗菌作用，低濃度抑菌，高濃度殺菌。其作用機(jī)制可能是:(1)破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)。(2)抑制細(xì)菌糖代謝，黃連能抑制酵母菌及細(xì)菌糖代謝的中間環(huán)節(jié)丙酮酸的氧化脫羧過程。(3)抑制核酸、蛋白質(zhì)合成。

本實(shí)驗(yàn)參考王育紅等［7］24種中藥水煎劑對臨床菌株的體外抑菌作用的藥劑配制及實(shí)驗(yàn)方法。采用常規(guī)抑菌實(shí)驗(yàn)方法——瓊脂稀釋法，培養(yǎng)基選用M-H瓊脂對六種中藥進(jìn)行定量抗菌實(shí)驗(yàn)研究。避免了普通的營養(yǎng)瓊脂中所含某些成分會與中藥的抗菌物質(zhì)結(jié)合而抑制藥物本身的抗菌作用，可大大提高抑菌實(shí)驗(yàn)的靈敏度，也更能精確地反映出6種中藥對糞腸球菌的抑菌效果。并能夠精確測出各種中草藥的MIC值，達(dá)到精確篩選抗菌中草藥的目的。

實(shí)驗(yàn)選用32株不同源臨床分離糞腸球菌菌株。實(shí)驗(yàn)菌株是反映抗菌效果的重要指標(biāo)。不同源菌株對抗菌藥物耐藥程度各不相同，與以往實(shí)驗(yàn)使用同源菌株不同，本實(shí)驗(yàn)具有多源性、多樣性的特點(diǎn)，更接近臨床情況，也更具有代表性和可重復(fù)性，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加貼近臨床，更能客觀地反映出每種中藥對臨床糞腸球菌的抑菌效果。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)中藥的不同提取方法對其抗菌效果有較大影響。這可能與中藥的有效成分是水溶性還是脂溶性有關(guān)。同時(shí)各批次間藥物本身質(zhì)量的不穩(wěn)定性也在很大程度上影響了藥物濃度的精確獲得，限制了其在臨床上的應(yīng)用。牙體牙髓疾病是混合細(xì)菌感染的過程，僅對其中某一種細(xì)菌有較強(qiáng)抗菌效果的藥物在臨床治療中未必能達(dá)到理想的療效，這也是我們將進(jìn)一步研究的方向。

1 Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，et al.Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment.J Endod，2006，32:93-98.

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5 李仲興，王秀華.應(yīng)用M-H瓊脂進(jìn)行五倍子等5種中藥對28株腸球菌的體外抗菌活性觀察.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11:1064-1066.

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R 187.1

A

1002－7386(2012)17－2580－03

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.007

項(xiàng)目來源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號:20110184)

050051 河北省石家莊市第二醫(yī)院口腔科(于靜、戴東曉、謝景朝、李軍如);河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科(陳惠珍)

陳惠珍，050000 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科; E-mail:yhzy359@126.com

2012－02－29)